利用透膜熒光小分子探針對(duì)半胱氨酸組織蛋白酶蛋白活性表達(dá)譜的研究.pdf

1、在后基因組時(shí)代，最重要的工作就是要從整體水平上了解蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能。在眾多的蛋白質(zhì)分析方法中，蛋白質(zhì)活性表達(dá)譜（activity-based protein profiling,ABPP）是研究酶的表達(dá)和功能的主要方法之一，這種方法的主要工具是一種基于酶活性的小分子探針（activity-based probe,ABP）。ABP探針是運(yùn)用有機(jī)化學(xué)方法人工合成的靶向性小分子探針，利用它可以將蛋白質(zhì)組中一類特定的蛋白酶識(shí)別標(biāo)記，隨后通過(guò)凝

2、膠電泳、質(zhì)譜鑒定等方法手段，對(duì)酶的表達(dá)和功能進(jìn)行一系列分析。
　　細(xì)胞膜是阻止胞外物質(zhì)自由進(jìn)入細(xì)胞的屏障，也為ABP探針在活細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)用帶來(lái)一定困難。突破細(xì)胞膜的限制，實(shí)現(xiàn)ABP探針在活細(xì)胞以及在體水平的應(yīng)用，是蛋白質(zhì)活性表達(dá)譜研究的重要發(fā)展方向。本課題將細(xì)胞穿膜肽（cell-penetrating peptide,CPP）應(yīng)用到ABP探針的設(shè)計(jì)中，合成了針對(duì)半胱氨酸組織蛋白酶的特異性探針：CpFABP和TCpABP。利用TCpA

3、BP探針標(biāo)記活細(xì)胞中的半胱氨酸組織蛋白酶，對(duì)標(biāo)記蛋白酶進(jìn)行了基于質(zhì)譜技術(shù)的鑒定分析；將CpFABP探針作為一類新型的溶酶體標(biāo)記物，對(duì)溶酶體依賴型細(xì)胞凋亡的起始階段進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光成像分析。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）用固相和液相結(jié)合的方式合成了針對(duì)半胱氨酸組織蛋白酶的一系列ABP探針，包括含有八聚精氨酸和環(huán)氧探頭的CpFABP、TCpABP透膜探針以及幾種用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)的探針。通過(guò)改進(jìn)純化辦法，解決了透膜探針在純化的過(guò)程中容易發(fā)生環(huán)

4、氧開(kāi)環(huán)的問(wèn)題，獲得高純度的探針。
　　（2）TCpABP探針含有反應(yīng)基團(tuán)、熒光基團(tuán)和Biotin基團(tuán)，是一種具有透膜能力的三功能（trifunctional）探針。研究結(jié)果表明，盡管這種三功能探針含有不能夠透膜的熒光基團(tuán)和Biotin基團(tuán)，但是因?yàn)樘结樦泻邪司劬彼岽┠る模琓CpABP探針能夠有效透膜進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞中對(duì)活性狀態(tài)的半胱氨酸組織蛋白酶的標(biāo)記。利用TCpABP探針中的Biotin基團(tuán)，我們富集了被標(biāo)記的活性半

5、胱氨酸組織蛋白酶，并且通過(guò)步驟優(yōu)化減少了非特異性結(jié)合的蛋白，降低了背景蛋白數(shù)量。在經(jīng)過(guò)質(zhì)譜鑒定之后，我們總共得到59個(gè)蛋白質(zhì)，包括7種半胱氨酸組織蛋白酶，其中兩種（Cathepsin F,Cathepsin O）在以前的ABPP分析中是沒(méi)有被檢測(cè)到的。我們通過(guò)基于圖譜計(jì)數(shù)的非標(biāo)定量方法對(duì)已鑒定蛋白進(jìn)行相對(duì)定量分析，發(fā)現(xiàn)半胱氨酸組織蛋白酶大多豐度值很高，而其余的52個(gè)蛋白的豐度較低。這些研究證明了TCpABP探針在活細(xì)胞對(duì)半胱氨酸組織蛋白

6、酶標(biāo)記的高特異性，堿洗富集策略降低背景的有效性和“一步法”鑒定的高靈敏性。將鑒定的半胱氨酸組織蛋白酶的的相對(duì)活性值同mRNA的轉(zhuǎn)錄水平的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)在7種組織蛋白酶中，六種的蛋白活性水平同mRNA轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)性很好，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.84，但是Cathepsin H的蛋白活性水平同mRNA的水平差異很大，說(shuō)明其mRNA水平同蛋白質(zhì)的表達(dá)是不成線性的。
　　（3）在正常的生理?xiàng)l件下，活性半胱氨酸組織蛋白酶定位在溶酶體中，我們

7、系統(tǒng)評(píng)估了CpFABP探針作為一種新型的溶酶體標(biāo)記物標(biāo)記溶酶體的特性。通過(guò)與商用的溶酶體標(biāo)記物L(fēng)ysoTracker進(jìn)行共定位分析，結(jié)果表明CpFABP探針能夠在各種不同類型的培養(yǎng)細(xì)胞中有效的標(biāo)記溶酶體。此外，CpFABP探針在標(biāo)記溶酶體后，可用于細(xì)胞固定，細(xì)胞膜透化作用以及氯化銨堿化處理等各種操作；而在相同的條件下，商用的LysoTracker失去了標(biāo)記能力，顯示了CpFABP探針作為溶酶體標(biāo)記物具有自己獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在溶酶體依賴型凋亡