動態(tài)壓力促進(jìn)骨基質(zhì)支架中微血管形成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 分離、獲取大鼠骨髓單個核細(xì)胞,條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)成血管內(nèi)皮祖細(xì)胞,觀察體外培養(yǎng)主要生物學(xué)特點(diǎn),免疫組化及免疫熒光鑒定。在體外制備豬脫鈣骨基質(zhì)支架,電鏡掃面觀察組織形態(tài)。將血管內(nèi)皮祖細(xì)胞種植在脫鈣骨基質(zhì)支架上,將細(xì)胞-支架復(fù)合體置于生物型壓力反應(yīng)器給予適當(dāng)壓力干預(yù),觀察其形成血管能力。
　　 方法：
　　 取50克Wistar大鼠,采用密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁篩選法分離出骨髓單個核細(xì)胞,用條件培養(yǎng)液從原

2、代開始誘導(dǎo)培養(yǎng),誘導(dǎo)其形成血管內(nèi)皮祖細(xì)胞,并對誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化及免疫熒光鑒定。取適當(dāng)大小豬脊柱椎體松質(zhì)骨,通過組織固定、脫脂、脫鈣等步驟制備出脫鈣骨基質(zhì)支架。取第三代血管內(nèi)皮祖細(xì)胞種植在脫鈣骨基質(zhì)支架,將細(xì)胞-支架復(fù)合物隨機(jī)分為A、B兩組,A組置放在生物型壓力反應(yīng)器,給予1Hz頻率,5％形變壓力值,五天后將細(xì)胞-支架復(fù)合物取出,繼續(xù)培養(yǎng)直至兩周,B組直接培養(yǎng)兩周,觀察兩組支架上的細(xì)胞血管形成能力。RT-PCR檢測兩組EPCs分化相關(guān)

3、因子mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 新提取的細(xì)胞呈圓形,大小不一。24小時差速貼壁,36小時后可見部分細(xì)胞貼壁,并逐漸出現(xiàn)梭形、三角形、紡錘形或不規(guī)則形等形態(tài)。7天左右出現(xiàn)細(xì)胞集落,中央呈圓形,周圍梭形細(xì)胞放射性生長。10～12天集落細(xì)胞呈單層鋪路石樣生長。細(xì)胞-支架復(fù)合物電鏡下可見脫鈣骨基質(zhì)孔隙網(wǎng)架結(jié)構(gòu),骨小梁、小梁間隙和骨內(nèi)管腔系統(tǒng)同時存在,細(xì)胞鋪滿材料表面,臨近細(xì)胞相互融合。A、B兩組HE染色和熒光染色可見血管

4、束形成,且A組細(xì)胞明顯多于B組。用RT-PCR法檢測兩組EPCs培養(yǎng)后vWF和Flk-1 mRNA的表達(dá)情況,A組表達(dá)明顯強(qiáng)于B組。
　　 結(jié)論：
　　 密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁法提取血管內(nèi)皮祖細(xì)胞簡便、快捷,生長狀態(tài)穩(wěn)定,增殖能力強(qiáng)。可以認(rèn)為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞是一種理想的骨組織工程種子細(xì)胞。脫鈣骨基質(zhì)是一種良好的載體支架材料,與血管內(nèi)皮祖細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織工程骨給予適當(dāng)壓力干預(yù)后能明顯促進(jìn)移植骨的血管化,在修復(fù)骨缺損方面具