hBMP-2基因修飾自體BMSCs移植促進兔下頜骨牽張成骨新骨形成的實驗研究.pdf

1、目的：
　　牽張成骨(distraction osteogenesis，DO)是利用骨創(chuàng)傷后骨痂愈合機理產(chǎn)生新骨的一項內(nèi)源性骨組織工程技術(shù)，已成為國內(nèi)外口腔頜面外科研究的熱點之一，并且隨著近幾年來的大量基礎(chǔ)和臨床研究，展現(xiàn)了該技術(shù)在顱頜面整形、腫瘤術(shù)后重建、牙槽種植等方面廣闊的應用前景。盡管DO技術(shù)具有傳統(tǒng)手術(shù)難以比擬的優(yōu)勢，但過長的牽張和固定時間，以及由此而產(chǎn)生的諸多并發(fā)癥是限制其臨床應用的主要原因。如何提高DO過程中新骨形成的

2、速度和質(zhì)量，縮短DO治療時間，減少并發(fā)癥的發(fā)生是目前該領(lǐng)域的研究熱點。本研究的目的是擬通過RT-PCR技術(shù)從入骨肉瘤中提取并擴增hBMP-2基因片段，通過酶切技術(shù)將其插入pcDNA3.1構(gòu)建成真核表達載體，利用基因轉(zhuǎn)染方法將其導入兔骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)，并檢測其在MSCs中的表達情況。然后將BMP-2基因修飾的自體MSCs植入兔下頜牽張成骨區(qū)，通過細胞可控地在需要的時段持續(xù)表達BMP-2，誘導MSCs自身或牽張成骨區(qū)的多潛能干細

3、胞以及可能的成纖維細胞向成骨或成軟骨細胞分化，模擬胚胎骨形成或骨折愈合的自然發(fā)生過程，使成骨級聯(lián)再次啟動，重續(xù)定向成骨分化，最終達到促進牽張成骨新骨形成與改建，從而大大縮短牽張成骨治療周期，為進一步在臨床上廣泛使用牽張成骨技術(shù)治療各種骨創(chuàng)傷或骨缺損奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、取2-3月齡健康新西蘭白兔，穿刺抽取雙側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子部位骨髓約4-6 ml，采用貼壁分離法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，通過細胞形態(tài)學觀察和細胞表面抗原檢

4、測對細胞進行鑒定;并向成骨細胞分化誘導培養(yǎng)，通過鈣鉆法檢測堿性磷酸酶表達，茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成能力。
　　2、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術(shù)，從入骨肉瘤中擴增出人骨形成蛋白-2基因片段，通過DNA重組技術(shù)將該基因片段重組于pcDNA3.1真核表達載體上，構(gòu)建成pcDNA3.1-hBMP-2重組質(zhì)粒。通過用PCR擴增、酶切電泳分析及DNA測序的方法對重組DNA進行鑒定。
　　3、采用比較成熟的脂質(zhì)體介導的真核

5、細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將含人BMP-2編碼序列的真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔BMSCs，通過逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(RT-PCR)、免疫印跡法(westernblot)以及免疫組化等手段檢測BMP-2-mRNA及其蛋白的表達。
　　4、取健康新西蘭白兔36只隨機分為3組，每組12只。實驗組(注射BMP-2基因修飾的自體MSCs)、對照組（注射自體MSCs）、空白組（注射生理鹽水）。術(shù)前3-4周分別根據(jù)編號對實驗組及對照組動物自脛骨上端穿刺抽取骨髓，并

6、做好對應編號進行傳代培養(yǎng)，將兔自體MSCs培養(yǎng)傳代至第P3代細胞后用hBMP-2基因轉(zhuǎn)染修飾。建立牽張成骨動物模型，術(shù)后延遲期為5天，從術(shù)后第6天開始牽張，每天2次，每次0.5mm牽張，牽張長度7mm，隨后固定。在固定期第2天，實驗組于牽張間隙注射200μl的自體BMP-2基因修飾的自體MSCs液;對照組注射200μl的自體MSCs液;空白組注射200μl生理鹽水。分別于牽張結(jié)束固定2w、6w分別攝X線片觀察骨質(zhì)愈合、改建情況;在固定術(shù)

7、后2周、6周各實驗組分別處死動物6只，通過大體病理、HE染色組織切片及掃面電鏡觀察各實驗組新骨形成情況，并通過逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(RT-PCR)、免疫組化等手段檢測BMP-2-mRNA及其蛋白的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1、兔骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及向成骨細胞分化誘導:
　　MSCs剛分離接種時，其內(nèi)血細胞混雜，成分不易分辨。3天后首次換液，可見貼壁細胞呈三角形、成纖維形、多角形或短梭形外觀，培養(yǎng)10-20天后

8、細胞長滿瓶底，可見成纖維樣細胞克隆樣增殖，成片生長。傳代后觀察:傳代后細胞增殖速度明顯加快，細胞排列整齊有序。使用條件培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)2周，細胞呈集落生長后開始形成鈣結(jié)節(jié)，茜素紅染色陽性，證明MSC已被誘導成為成骨細胞。
　　2、經(jīng)PCR擴增、酶切電泳分析和DNA測序證實，本實驗成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒目的基因片段為人BMP-2-cDNA。
　　3、通過脂質(zhì)體介導的真核轉(zhuǎn)染方法能成功將外源hBMP-2基因轉(zhuǎn)入兔骨髓間充質(zhì)干細胞，并經(jīng)

9、RT-PCR、免疫組化和蛋白印跡法證實，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-hBMP-2后的兔骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)有大量hBMP-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達。
　　4、動物實驗:于牽張結(jié)束固定2w、6w取標本，通過大體病理觀察，從新生骨表面看，從質(zhì)量或者硬度上由高到低排列為:實驗組＞對照組=空白組;通過X線觀察并經(jīng)過灰度值統(tǒng)計軟件分析，在固定期第2周及6周實驗組牽張區(qū)骨密度明顯高于對照組和空白組(p＜0.01)，在各期對照組和空白組牽張區(qū)骨密

10、度比較未見明顯差異(p＞0.05);固定2w、6w通過RT-PCR檢測并通過電泳圖像灰度值分析，實驗組BMP-2mRNA相對光密度值顯著高于對照組和空白組(P＜0.01)，而對照組和空白組BMP-2mRNA表達差別不大(P＞0.05);通過免疫組化顯示:實驗組固定2周、6周牽張間隙新生骨組織中均可見BMP-2強陽性表達，實驗組平均灰度值低于對照組和空白組(P＜0.01)，而對照組和空白組間無差別(P＞0.05)。
　　結(jié)論：

11、>　　1、全骨髓貼壁換液方法是一種簡單實用的分離培養(yǎng)方法，可獲得純度較高的兔骨髓間充質(zhì)干細胞;原代和傳代保持了較高的增殖活力，經(jīng)過誘導后可向成骨細胞分化，選取組織工程種子細胞以3代以前較為適宜。
　　2、成功構(gòu)建了入骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-hBMP-2，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
　　3、通過脂質(zhì)體介導的真核轉(zhuǎn)染方法可以將外源hBMP-2基因轉(zhuǎn)入骨髓間充質(zhì)干細胞，并使其獲得較為穩(wěn)定的表達。
　　4