BCP-Dox支架復合大鼠PPARγ基因沉默BMSC治療大鼠骨缺損的實驗研究.pdf

1、本文分三個章節(jié)進行探討：
　　第一章：載體的構建、細胞的分離培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
　　目的：構建過氧化物酶增殖物活化受體γ（Peroxisome pmlifemtor-activated receptorγ，PPARγ）基因的發(fā)夾狀干擾RNA（shRNA）并攜帶鹽酸強力霉素（Doxycycline hyclate，Dox）正向調(diào)控“Tet-On”系統(tǒng)的表達載體。轉(zhuǎn)染大鼠BMSC，觀察并比較不同濃度四環(huán)素誘導后BMSC中PPARγ基因沉

2、默情況，成骨及成脂分化情況。
　　方法：利用RNAi技術，以小鼠PPARγ基因為靶基因，構建靶向小鼠PPARγ基因的“Tet-On”慢病毒載體，除了攜帶目的基因PPARγ-shRNA外，還將攜帶四環(huán)素正向調(diào)控的“Tet-On”系統(tǒng)和紅色熒光蛋白（RFP）基因標記。通過將測序正確的慢病毒載體包裝并測定滴度后，轉(zhuǎn)染大鼠 BMSC，觀察紅色熒光蛋白的表達變化情況。RT-PCR（Real-time quantitative PCR）檢測P

3、PARγ-mRNA、成脂因子ADD1-mRNA和成骨因子Collagen I-mRNA的表達水平，Western blot檢測PPARγ蛋白、ADD1蛋白和Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）的表達，從而確定轉(zhuǎn)染后PPARγ基因的沉默效應。分別將轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞（Transfected mesenchymal stem cells,tBMSC）向成骨誘導，通過轉(zhuǎn)染前后堿性磷酸酶（ALP）定性檢測成骨分化能力；向成脂分化方向誘導，通

4、過轉(zhuǎn)染前后油紅-O染色對比成脂能力。
　　結果：設計并篩選出shRNA序列：GTCTGCTGATCTGCGAGCC。成功構建了PPARγ基因的“Tet-On”慢病毒載體，測量滴度為3.6×10E8TU/ml，轉(zhuǎn)染大鼠BMSC后，與未轉(zhuǎn)染BMSC比較，PPARγ-mRNA24h（hours）抑制率為36％（P<0.01）；ADD13d（days）下調(diào)表達32％（p<0.05），7d表達下調(diào)75％（p<0.01）；Ⅰ型膠原3d表達上調(diào)

5、37％（p<0.05），7d表達上調(diào)66％（p<0.01）；48h PPARγ蛋白抑制率為53％（p<0.01）。與未轉(zhuǎn)染BMSC比較，轉(zhuǎn)染的tBMSC成骨誘導9d后，在2～8μg/ml時隨鹽酸強力霉素（Doxycycline hyclate，Dox）的濃度增大ALP活性增強，在8μg/ml成骨能力最強，在10μg/ml時呈現(xiàn)下降趨勢；成脂誘導14d后，OD值測定tBMSC組顯著降低61％（p<0.01）。
　　結論：慢病毒轉(zhuǎn)染大

6、鼠BMSC轉(zhuǎn)染效率高，轉(zhuǎn)染的BMSC增殖能力強，成脂分化減弱，成骨分化增強，傳代后PPARγ沉默效應穩(wěn)定。Dox對目的基因表達調(diào)控存在濃度依賴關系，在8μg/ml時Dox調(diào)控作用最強。
　　第二章：HA/PLLA涂層BCP支架材料制備、Dox微球的制備與支架復合
　　目的：采用將Dox包裹于微球中，再沉積于生物活性雙相磷酸鈣（Biphasic calcium phosphate，BCP）支架上，組成組織工程“BCP/Dox”

7、緩釋系統(tǒng)。
　　方法：采用的是有機泡沫浸漬法制備圓盤狀2mm×5mm（直徑 R=5mm）BCP多孔支架，用羥基磷灰石/左旋聚乳酸（HA/PLLA）涂層兩遍。通過雙乳液法制備聚乙丙交酯-聚乙二醇（PLGA-mPEG,LA/GA=9:1）共聚物載Dox微球，將制備出的載藥微球涂層BCP多孔支架上，傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和掃描電鏡（SEM）對支架材料的表面結構和形態(tài)學進行分析，并進行體外PBS溶液中的釋藥實驗。
　　結果：

8、制備的的載Dox微球載藥量為0.5％，包封率為24.7％；電鏡顯示微球尺寸在15～20μm，大小分布均勻，在孔徑300～600μm的多孔HA/PLLA涂層BCP支架上容易粘附。體外PBS緩沖液中釋放顯示，前16h內(nèi)有爆釋現(xiàn)象，其中8h釋放月32.6％，7d釋放65.5％，7d后進入緩慢釋放階段，可控制釋放約60d。
　　結論：BCP支架孔徑為300～600μm、孔隙率90.8％～92.3％、力學性能4.8～5.73MPa，可以滿足

9、松質(zhì)骨壓縮強度的要求。載Dox微球大小均勻，可以良好地附著BCP多孔支架上，有良好緩釋作用。
　　第三章：復合tBMSC的多孔BCP/Dox支架治療大鼠骨缺損的研究
　　目的：將“BCP/Dox”支架緩釋系統(tǒng)，復合轉(zhuǎn)染的大鼠tBMSC后，植入骨缺損處。通過Dox緩慢持續(xù)釋放，調(diào)控tBMSC在骨缺損處向成骨方向分化，作為骨修復材料治療大鼠骨骨缺損，探討骨缺損的靶向基因治療新的方法和策略。
　　方法：體外實驗利用BMSC和

10、tBMSC對BCP/Dox支架在6h和24h時的粘附，細胞計數(shù)后驗證支架的粘附性；通過1、3、5d的MTT實驗去驗證BCP/Dox支架對細胞增殖的影響；通過誘導9d時的ALP染色和11d時茜素紅染色驗證BCP/Dox支架對BMSC和tBMSC的成骨分化的影響；14d后油紅-O染色驗證支架材料對BMSC和tBMSC成脂分化的影響。體內(nèi)驗證BCP/Dox支架的急性毒性實驗、致敏試驗、溶血實驗。實施異位成骨實驗，采用SD-大鼠30只，制作右大

11、腿后內(nèi)側肌袋，植入一片BCP/Dox支架材料，分別在1d、1w、2w、3w和4w分批處死各6只取材并進行HE染色，觀察免疫反應和異位成骨情況。SD-大鼠45只，制作大鼠顱骨右后囟5mm圓形骨缺損模型，隨機分為A組9只、B組18和C組18只，A組為空白對照；B植入P4代BMSC+BCP/Dox；C組植入P4代tBMSC+BCP/Dox。在4、8和12w分批處死，X線和Micro-CT分析支架的成骨量。
　　結果：在BCP/Dox支架

12、的影響下，6h和24h后tBMSC組比BMSC組粘附率低，兩組比較無統(tǒng)計學意義（p>0.05），24h后粘附率均在70％以上。增殖率在1d和3d各組無明顯區(qū)別；5d后，tBMSC+BCP/Dox組和BMSC+BCP/Dox組增殖率低于BMSC組，無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。5d后電鏡掃描顯示BCP/Dox支架細胞周圍有細胞外基質(zhì)及載Dox的PLGA-mPEG微球。三組細胞的ALP定量分析，6d和9d時，BMSC+BCP/Dox組較 B

13、MSC組有明顯統(tǒng)計學意義（p<0.01）；tBMSC+BCP/Dox組較 BMSC+BCP/Dox組有明顯統(tǒng)計學意義（p<0.01）；12d時，兩組與對照組比較均有明顯統(tǒng)計學意義（p<0.01）。鈣結節(jié)染色，顯示三組細胞外散布鈣結節(jié)， tBMSC+BCP/Dox組>BMSC+BCP/Dox組>BMSC組。油紅-O染色分析，誘導14d后，tBMSC+BCP/Dox組較BMSC+BCP/Dox組和 BMSC組明顯減少，有明顯統(tǒng)計學意義（p<

14、0.01）；BMSC+BCP/Dox組