miR-27a通過靶向調(diào)控PPARγ對酒精誘導(dǎo)大鼠BMSC分化的影響.pdf

1、研究背景:
　　股骨頭壞死是一種臨床上非常常見的關(guān)節(jié)疾病，該病病因復(fù)雜，致殘率高，一旦發(fā)病往往需要手術(shù)治療，迄今罕有有效的預(yù)防方法，對患者的生活質(zhì)量和生命健康都是一種嚴重威脅。
　　目前非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死(Osteonecrosis of the femoral head， ONFH)日益多見，大量研究證明，慢性股骨頭壞死多與激素和酒精的攝入有關(guān)。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在中國，慢性酒精中毒已經(jīng)是誘發(fā) ONFH的主要原因之一。有

2、研究表明，通過對大鼠、小鼠、家兔和雞等長期使用大劑量酒精灌胃處理后，動物會在一定時間后出現(xiàn)明顯的股骨頭壞死現(xiàn)象。骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是一種多能干細胞，主要分化為成骨細胞，并能夠分化為脂肪細胞、心肌細胞和神經(jīng)細胞等。體外培養(yǎng)的BMSCs經(jīng)過酒精誘導(dǎo)后，會大量分化成脂肪樣細胞，喪失成骨能力。
　　過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferators-

3、activated receptorγ，PPARγ)基因是一種關(guān)鍵的成脂轉(zhuǎn)錄因子，其在脂肪細胞中表達量非常高，且PPARγ的激活與干細胞的分化命運密切相關(guān)。大量研究表明，BMSC中PPARγ的激活會導(dǎo)致細胞成骨分化受阻，細胞轉(zhuǎn)而向成脂方向分化，該過程在股骨頭壞死過程中表現(xiàn)為骨質(zhì)喪失和骨骼或關(guān)節(jié)修復(fù)受阻。
　　MicroRNA是一種長度約20~24個核苷酸的短鏈非編碼RNA，不同類型的microRNA根據(jù)其特異的核苷酸序列可以靶向作

4、用于不同基因的 mRNA，在mRNA轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達狀況。microRNAs的正常表達對維持正常生命活動至關(guān)重要，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約60％的人類基因受microRNAs的調(diào)控。一個microRNA可以靶向調(diào)節(jié)多個基因，并且一個基因也可以被多個 microRNAs所調(diào)控。我們通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)microRNA-27a能夠與PPARγ基因靶向配對，抑制BMSC中PPARγ的表達，阻礙BMSC的成脂分化，進而使BMSC正常的成骨分化

5、能力得以恢復(fù)，從而達到對酒精性O(shè)NFH發(fā)生的抑制作用。
　　研究目的：
　　本實驗通過體外合成 microRNA-27a mimics導(dǎo)入大鼠 BMSCs細胞，觀察microRNA-27a對PPARγ基因的靶向調(diào)控作用，及對酒精誘導(dǎo)的BMSC成脂和成骨分化的影響，以此探討microRNA在ONFH的發(fā)生及防治中的作用。
　　方法：
　　1.實驗分組：將大鼠 BMSCs以1×106/cm2細胞密度，接種于6孔培養(yǎng)板

6、，當細胞融合至80%時應(yīng)用microRNA mimics進行電擊穿孔法轉(zhuǎn)染，同時隨機分組：
　?、倏瞻讓φ战M：正常培養(yǎng)細胞，不做特殊處理。
　?、诰凭Ｐ徒M：培養(yǎng)液中給予0.09 mol/L的酒精。
　?、踡icroRNA-27a組：microRNA-27a mimics轉(zhuǎn)染細胞，并給予濃度為0.09 mol/L的酒精同時處理。
　?、躈egative control組：無關(guān)序列合成mimics轉(zhuǎn)染細胞，并給予濃

7、度為0.09 mol/L的酒精同時處理。
　　2.熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測microRNA-27a與PPARγ3’UTR的結(jié)合情況。
　　3.實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR, Q-PCR）檢測各組BMSCs中PAPRγ和Runx2基因表達的水平。
　　4.酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）檢測各組中堿性磷酸酶（

8、alkaline phosphatase，ALP）活性、I型膠原（type I collagen）和骨鈣素（osteocalcin, OCN）含量的差異。
　　5.免疫印跡法（Western blot）檢測各組BMSCs中Runx2和PPARγ的蛋白表達水平。
　　6.脂肪染色及脂肪細胞計數(shù)檢測 BMSCs酒精誘導(dǎo)后脂肪生成的狀態(tài)和成脂分化的程度。
　　7.酶偶聯(lián)比色法檢測BMSCs中甘油三酯（TG）的含量。
　

9、　結(jié)果：
　　1）熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實microRNA-27a可以與PPARγ3’-UTR相結(jié)合，即PPARγ是microRNA-27a的靶基因。
　　2）qPCR結(jié)果顯示：酒精處理后，酒精模型組和NC組BMSC中PPARγmRNA表達量均高于空白對照組和microRNA-27a組（P＜0.01），空白對照組和microRNA-27a組比較，以及酒精模型組和 NC組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）；與此相反，酒精模

10、型組和NC組BMSC中Runx2 mRNA表達量均低于空白對照組和microRNA-27a組（P＜0.01），空白對照組與microRNA-27a組比較，以及酒精模型組和NC組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。
　　3）ALP檢測結(jié)果顯示：與空白對照組比較，酒精模型組和NC組BMSC經(jīng)酒精處理后 ALP含量均有下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（ P＜0.01），而microRNA-27a組中ALP含量與空白對照組近似，差異無統(tǒng)計學(xué)意

11、義（P﹥0.05）。
　　4）I型膠原檢測結(jié)果顯示：與空白對照組比較，酒精模型組和NC組BMSC經(jīng)酒精處理后 I型膠原含量均有下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而microRNA-27a組中 I型膠原含量與空白對照組近似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。
　　5）OCN檢測結(jié)果顯示：酒精模型組和NC組培養(yǎng)液中OCN的含量與空白對照組及microRNA-27a組比較均有下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）?？瞻讓?/p>

12、照組與microRNA-27a組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。
　　6）Western blot結(jié)果顯示：酒精模型組和 NC組與空白對照組比較 BMSC中 PPARγ的蛋白表達量明顯上升（P＜0.01），microRNA-27a組 PPARγ蛋白表達水平與空白對照組接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。同時，酒精模型組和NC組與空白對照組比較BMSC中Runx2的蛋白表達量明顯下降（P＜0.01）， microRNA-

13、27a組 Runx2蛋白表達水平與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。
　　7）脂肪染色及脂肪細胞計數(shù)結(jié)果：油紅 O染色顯示，空白對照組和microRNA27a組細胞中罕見脂滴生成且極少出現(xiàn)脂肪細胞；酒精模型組及 NC組細胞，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)較多脂肪滴且有大量脂肪細胞生成，著色后呈棕紅色。脂肪細胞計數(shù)結(jié)果顯示，酒精模型組和NC組脂肪細胞生成數(shù)比microRNA-27a組和空白對照明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（ P＜0.01）；空

14、白對照組與microRNA-27a組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。
　　8）TG含量測定結(jié)果顯示，酒精模型組和NC組表達含量均高于空白對照組與 microRNA-27a組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（ P＜0.01）?？瞻讓φ战M與microRNA-27a組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.microRNA27a能夠靶向調(diào)節(jié)PPARγ基因，下調(diào)BMSC中PPARγ基因的表達，減少脂肪細胞生成