miR-196b-5p對脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控.pdf

1、背景和目的：隨著人類生活水平的日益提高，肥胖的發(fā)病率逐年升高，肥胖可以引起胰島素抵抗、糖尿病、癌癥、骨質(zhì)疏松等，因此，對于肥胖我們需要積極預(yù)防和治療。隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)，越來越多的的研究證明miRNA對脂肪細(xì)胞的分化具有一定影響。本研究以 miR-196b-5p為對象探討其對脂肪細(xì)胞分化的作用，預(yù)測并鑒定其靶基因，初步探討miR-196b-5p影響脂肪細(xì)胞分化的機制。
　　方法：1.對骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2進行脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并

2、利用 RT-qPCR檢測細(xì)胞分化過程中 miR-196b-5p的表達(dá)變化。對ST2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-196b-5p mimics及miR-196b-5p inhibitor并對細(xì)胞進行成脂誘導(dǎo)，利用 RT-qPCR、Western Blotting和油紅O染色等技術(shù)觀察miR-196b-5p對ST2細(xì)胞成脂分化的影響。2.利用靶基因預(yù)測軟件對miR-196b-5p的靶基因進行預(yù)測，構(gòu)建表達(dá)靶基因3′UTR的熒光素酶報告基因載體，利用熒光

3、素酶報告基因技術(shù)鑒定靶基因。探討miR-196b-5p調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的分子機制。
　　結(jié)果：1. miR-196b-5p在ST2細(xì)胞誘導(dǎo)成脂后表達(dá)上升，提示miR-196b-5p可能參與調(diào)控脂肪細(xì)胞分化。2.轉(zhuǎn)染miR-196b-5p mimics后，ST2細(xì)胞成脂特異性基因 PPARγ、C/EBPα、aP2和 adipsin的表達(dá)均上調(diào)，細(xì)胞分化成熟。而轉(zhuǎn)染miR-196b-5p inhibitor則與上述結(jié)果相反，表明miR

4、-196b-5p促進了脂肪細(xì)胞分化。3.生物信息學(xué)預(yù)測Tgfbr1、Nr2c2、Rbpj、Foxo1、Sema3a為miR-196b-5p的潛在靶基因。雙熒光素酶報告基因檢測顯示， miR-196b-5p mimics與Tgfbr1、Foxo13′UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞后熒光素酶活性顯著下降，但 miR-196b-5p mimics不能降低 Nr2c2、Rbpj、Sema3a3′UTR載體的熒光素酶活性。隨后我們

5、構(gòu)建了 Tgfbr1、Foxo13′UTR應(yīng)答序列的缺失突變體，將此突變體或其野生型質(zhì)粒與 miR-196b-5p mimics共轉(zhuǎn)染后，雙熒光素酶報告基因活性檢測結(jié)果顯示miR-196b-5p mimics不能抑制突變體熒光素酶活性，證實Tgfbr1、Foxo1是miR-196b-5p的靶基因。本研究證實miR-196b-5p促進骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成脂分化，其作用機制可能是通過靶向結(jié)合 Tgfbr1、Foxo1的3′UTR而阻斷其翻譯實現(xiàn)