生長(zhǎng)激素與其信號(hào)分子STAT5B對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響.pdf

1、本課題的工作分以下幾部分開展:
　　第一部分 生長(zhǎng)激素對(duì)脂肪細(xì)胞分化及脂肪組織的影響
　　目的:
　　探討生長(zhǎng)激素對(duì)3T3-L1前脂細(xì)胞分化過程中基因表達(dá)的影響以及生長(zhǎng)激素對(duì)高脂喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠內(nèi)臟脂肪組織中基因表達(dá)的影響。
　　內(nèi)容:
　　1.應(yīng)用3T3-L1前脂肪細(xì)胞作為模型，誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化。同時(shí)在分化過程中加入生長(zhǎng)激素(125 ng/ml)進(jìn)行干預(yù)，在分化的第0，2，3，4，5天收取細(xì)胞。檢

2、測(cè)脂肪代謝相關(guān)的分子如Fasn表達(dá)變化以及激素敏感性脂肪酶(Hormone-sensitive lipase，HSL)的活性變化。
　　2.構(gòu)建包裝靶向抑制STAT5B表達(dá)的shRNA慢病毒:LV3-STAT5B-shRNA，感染3T3-L1前脂細(xì)胞后篩選出STAT5B敲出的細(xì)胞克隆。以表達(dá)LV3-NC的慢病毒為陰性對(duì)照，分別誘導(dǎo)兩種脂肪細(xì)胞分化，分別在分化的第0，2，3，4，5，10天收取細(xì)胞。
　　3.分別用普通飼料和高

3、脂飼料喂養(yǎng)6周齡C57BL/6小鼠，在高脂喂養(yǎng)的小鼠中隨機(jī)選取部分進(jìn)行生長(zhǎng)激素腹腔注射，其余兩組注射滅菌的磷酸鹽緩沖液(Phosphate bufferedsaline，PBS)。
　　4.觀察GH在PKA抑制劑(H89)作用下對(duì)激素敏感性脂肪酶(Hormone-sensitivelipase，HSL)活性的影響。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)過誘導(dǎo)，兩組細(xì)胞均能進(jìn)行分化，但是油紅O染色顯示，在分化第五天時(shí)GH處理組細(xì)胞與對(duì)

4、照組相比分化效率明顯降低。對(duì)不同天數(shù)收取的兩組細(xì)胞樣品進(jìn)行Western blot分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，GH處理組細(xì)胞在分化過程中STAT5B基因一直處于活化狀態(tài)，與脂肪積累相關(guān)的蛋白如Fasn表達(dá)降低，與脂肪分解相關(guān)的p-HSL蛋白水平升高。
　　2.經(jīng)過加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選后，Western blot檢測(cè)證明，敲出STAT5B蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比降低到10％，基因表達(dá)干擾效果較好。分別對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化后，油紅O染色顯示

5、，在分化成熟后STAT5B敲出的細(xì)胞分化效率明顯高于對(duì)照組。對(duì)不同天數(shù)收取的兩組細(xì)胞樣品進(jìn)行Western blot分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，STAT5B敲出的細(xì)胞在分化過程中STAT5B基因也處于受抑制狀態(tài)表達(dá)降低，與脂肪積累相關(guān)的蛋白如Fasn表達(dá)與對(duì)照相比出現(xiàn)差異，其中Fasn表達(dá)呈逐漸升高趨，在第5天相比于對(duì)照組升高，與脂肪分解相關(guān)的p-HSL蛋白表達(dá)水平降低。經(jīng)過qPCR檢測(cè)，在分化至第10天時(shí)，STAT5B敲出的脂肪細(xì)胞中PP

6、ARγ，C/EBPα等mRNA水平與對(duì)照組相比表達(dá)均升高。
　　3.經(jīng)過12周的造模，高脂喂養(yǎng)組體重增長(zhǎng)超過本身的20％，成為肥胖模型組;而腹腔注射GH的高脂飲食組體重變化介于正常對(duì)照組和高脂喂養(yǎng)組之間，體重增長(zhǎng)沒有達(dá)到肥胖模型要求，其每日食物攝取和體質(zhì)百分?jǐn)?shù)均低于其他兩組。血糖濃度顯示GH注射組空腹血糖濃度接近于高脂喂養(yǎng)組，口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)(OGTT)實(shí)驗(yàn)表明GH注射組的糖耐量?jī)?yōu)于高脂喂養(yǎng)組，更接近于正常對(duì)照組（兩小時(shí)后血糖為

7、，正常對(duì)照組:8.6 mmol/L，GH注射組:10.4 mmol/L，高脂喂養(yǎng)組:14.6 mmol/L）。從生化指標(biāo)檢測(cè)來看，GH注射組與高脂喂養(yǎng)組相比能夠降低動(dòng)物血清中的甘油三酯(Triglycerides，TG)和膽固醇(Cholesterol，CHO)的含量。對(duì)內(nèi)臟脂肪組織進(jìn)行Western blot分析發(fā)現(xiàn)在GH注射組中p-HSL蛋白表達(dá)明顯高于高脂喂養(yǎng)組，但是低于正常對(duì)照組。
　　4.脂肪分化誘導(dǎo)劑本身就能夠活化HS

8、L，同時(shí)在蛋白激酶A(PKA)抑制劑(H89)的作用下p-HSL水平明顯降低，而且PKA活性的分子標(biāo)記p-CREB的水平也降低。生長(zhǎng)激素+誘導(dǎo)劑+H89的細(xì)胞中相比于誘導(dǎo)劑+H89組p-HSL和p-CREB水平升高。
　　結(jié)論:
　　1.在細(xì)胞模型和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，生長(zhǎng)激素作用能減緩脂肪細(xì)胞的分化或緩解高脂喂養(yǎng)引發(fā)的脂質(zhì)積累。
　　2.敲出STAT5B后，分化過程中Fasn和p-HSL變化與生長(zhǎng)激素作用時(shí)相反，提示生長(zhǎng)

9、激素可能通過STAT5B分子發(fā)揮對(duì)脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用。
　　3.在高脂喂養(yǎng)的動(dòng)物模型中，GH通過調(diào)節(jié)Fasn和p-HSL的水平來影響內(nèi)臟脂肪細(xì)胞組織。
　　4.生長(zhǎng)激素能夠通過PKA來影響p-HSL的水平。
　　第二部分 生長(zhǎng)激素信號(hào)通路中STAT5B影響脂肪細(xì)胞分化的機(jī)制研究
　　目的:
　　探討STAT5B在脂肪細(xì)胞分化過程中的作用機(jī)制。
　　內(nèi)容:
　　1.誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化，以

10、油紅O染色觀察脂肪細(xì)胞的分化程度。收取蛋白樣品檢測(cè)前脂細(xì)胞和成熟的脂肪細(xì)胞之間STAT5B等基因表達(dá)的差別。
　　2.誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化，以油紅O染色觀察脂肪細(xì)胞的分化程度。分別在第0，2，4，6，8，10天收取蛋白樣品，檢測(cè)STAT5B，MOF等基因在脂肪分化過程中的變化趨勢(shì)。
　　3.提取第一部分中所敘述的正常小鼠和高脂喂養(yǎng)小鼠中的內(nèi)臟脂肪組織進(jìn)行Western blot分析，檢測(cè)在動(dòng)物內(nèi)臟脂肪組織中STAT5B和

11、MOF的表達(dá)情況。
　　4.在STAT5B敲出的前脂細(xì)胞中檢測(cè)MOF的表達(dá)情況。
　　5.雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)STAT5B對(duì)MOF轉(zhuǎn)錄活性的影響，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，查找小鼠MOF基因的啟動(dòng)子序列，利用基因工程的方法構(gòu)建過表達(dá)STAT5B的載體以及多種MOF啟動(dòng)子（全長(zhǎng)啟動(dòng)子和部分啟動(dòng)子片段）的報(bào)告基因，同時(shí)在MOF啟動(dòng)子上對(duì)已經(jīng)報(bào)道的STAT5B結(jié)合位點(diǎn)（GAS序列）進(jìn)行突變，檢測(cè)熒光素酶活性。測(cè)定STAT5B在細(xì)胞內(nèi)能否促進(jìn)MOF

12、啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatinimmunoprecipitation，ChIP)的方法檢測(cè)在3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)STAT5B是否跟MOF啟動(dòng)子上的相關(guān)序列有物理的結(jié)合。
　　6.構(gòu)建包裝靶向抑制MOF基因表達(dá)的shRNA慢病毒:LV3-MOF-shRNA，感染3T3-L1前脂肪細(xì)胞后篩選出穩(wěn)定低表達(dá)MOF的細(xì)胞克隆。以表達(dá)LV3-NC的慢病毒為陰性對(duì)照，分別誘導(dǎo)兩種脂肪細(xì)胞分化，在分化的第0，10天收取

13、細(xì)胞。以qPCR，Westernblot檢測(cè)MOF表達(dá)敲出的細(xì)胞中脂肪分化相關(guān)的分子如（PPARγ，F(xiàn)asn，F(xiàn)abp4，等）表達(dá)情況。
　　7.構(gòu)建帶有FLAG標(biāo)簽的過表達(dá)MOF的載體，以及帶有CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteinα，C/EBPα)和PPARγ啟動(dòng)子序列的報(bào)告基因載體，利用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)MOF是否能夠抑制C/EBPα或PPARγ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。將C/E

14、BPα啟動(dòng)子分為多個(gè)片段，尋找MOF影響轉(zhuǎn)錄活性的區(qū)域。
　　結(jié)果:
　　1.分化成熟的脂肪細(xì)胞與3T3-L1前脂細(xì)胞相比STAT5B，MOF，H4K16ac等蛋白表達(dá)的水平均升高，其中MOF的mRNA表達(dá)水平也升高。
　　2.油紅O顯示在分化的第0，2，4，6，8，10天，隨著時(shí)間推移，脂肪細(xì)胞的數(shù)量逐漸的增多。Wesrten blot檢測(cè)結(jié)果顯示隨著脂肪細(xì)胞的分化，MOF蛋白的表達(dá)伴隨著STAT5B蛋白水平的增加而

15、增加。但是H4K16ac水平并沒有隨著MOF蛋白的增加而升高。
　　3.肥胖小鼠與正常對(duì)照小鼠相比STAT5B和MOF的蛋白水平都有顯著的增加，說明在動(dòng)物體內(nèi)與體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型中STAT5B和MOF表達(dá)的趨勢(shì)相一致。
　　4.慢病毒表達(dá)的shRNA可使3T3-L1前脂細(xì)胞中的STAT5B表達(dá)降低至對(duì)照的30％，同時(shí)MOF的蛋白水平也降低至對(duì)照的40％。
　　5.熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)STAT5B

16、蛋白或者GH刺激能夠增加MOF全長(zhǎng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。將全長(zhǎng)的啟動(dòng)子中假定的STAT5B結(jié)合位點(diǎn)突變之后，GH刺激后啟動(dòng)子失去活性。ChIP實(shí)驗(yàn)顯示，在分化成熟的脂肪細(xì)胞中STAT5B能夠結(jié)合于MOF啟動(dòng)子上的GAS序列。
　　6.慢病毒表達(dá)的shRNA可成功地敲出3T3-L1前脂細(xì)胞中MOF的表達(dá)，可降低至相應(yīng)對(duì)照的30％;前脂細(xì)胞敲出MOF表達(dá)后，在誘導(dǎo)分化過程中與脂肪分化相關(guān)的基因表達(dá)都有所升高，其中包括C/EBPα，PPAR

17、γ，F(xiàn)abp4，F(xiàn)asn。
　　7在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)MOF對(duì)PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性沒有影響，但能夠抑制C/EBPα的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步進(jìn)行啟動(dòng)子截短分析之后發(fā)現(xiàn)人為去除啟動(dòng)子-800bp到-200bp的片段后，過表達(dá)MOF不能抑制C/EBPα啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)論:
　　1.脂肪分化過程中STAT5B和MOF表達(dá)逐漸升高。
　　2.3T3-L1脂肪細(xì)胞中STAT5B通過調(diào)節(jié)MOF的表達(dá)，部分的調(diào)節(jié)脂肪分化。