生長激素與其信號轉(zhuǎn)導分子STAT5B對脂肪細胞的影響及其與胰島素信號的Crosstalk.pdf

1、肥胖癥，是機體代謝異常而導致體內(nèi)脂肪過度積累的一種慢性疾病，肥胖癥的發(fā)生會增加心血管疾病、代謝綜合征和2型糖尿病的罹患風險。機體脂肪細胞通過成纖維細胞樣前體脂肪細胞分化而來，前體脂肪細胞過度分化或者脂肪細胞體積增大與肥胖癥的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。
　　生長激素(growth hormone，GH)，由腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌，是分子量為22kDa的單一肽鏈蛋白質(zhì)激素，它是一種多功能的生長、代謝調(diào)節(jié)激素。GH與其受體二聚體結(jié)合，激活JA

2、K2，引發(fā)一系列信號通路。信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄因子STAT5是GH下游信號分子，其兩個亞型STAT5A及STAT5B分別由不同基因編碼，然而兩者高度同源，可高達96％。轉(zhuǎn)基因動物實驗研究表明:生長激素受體缺失了STAT5活化的序列可導致動物體型變小及肥胖。STAT5B在GH信號通路中發(fā)揮重要作用，然而其在脂肪分化過程中的作用及其對脂肪積累的機制并不明確，闡明其相應機制可為防治肥胖提供較好的理論基礎，也可為新藥的發(fā)現(xiàn)提供很好的線索。
　　

3、生長激素與胰島素在機體生長發(fā)育及代謝中都發(fā)揮重要的作用，在整個機體中，這兩種激素協(xié)調(diào)作用以維持機體代謝的平衡。生長激素與胰島素的信號途徑中都有PI3K及ERK兩種通路，而生長激素還有STAT5途徑。這兩種激素在脂肪細胞中有什么樣的協(xié)同作用或抑制作用有待于去探索。
　　本課題的工作分以下三部分開展:
　　第一部分、生長激素對成熟3T3-F442A脂肪細胞基因表達的影響研究
　　目的:探討生長激素對成熟脂肪細胞基因表達的影

4、響
　　研究內(nèi)容:
　　1.誘導脂肪前體細胞3T3-F442A分化成脂肪細胞，用油紅O染色法鑒定脂肪細胞內(nèi)甘油三酯的存在，并以異丙醇萃取法對油紅O著色的甘油三脂在490nm波長處進行定量;
　　2.顯微觀察并收集各分化時期細胞樣本。檢測脂肪細胞分化過程中分化標志分子（如PPARγ、C/EBPβ、FAS等）的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達水平;
　　3.對分化成熟的3T3-F442A脂肪細胞進行生長激素干預(對照組用

5、PBS)，對其mRNA進行Microarray分析，從而找到差異表達基因并對其結(jié)果進行RT-PCR驗證;
　　4.用125 ng/mL的生長激素劑量對成熟3T3-F442A脂肪細胞刺激24 h及48 h（對照用等體積PBS刺激細胞），然后檢測SOCS家族、脂聯(lián)素及其受體mRNA表達水平;
　　5.用125 ng/mL的生長激素劑量對成熟3T3-F442A脂肪細胞刺激24 h及48 h（對照用等體積PBS刺激細胞），運用Rea

6、l-Time PCR技術(shù)，檢測脂肪合成及分解相關(guān)基因的mRNA水平;
　　6.用125 ng/mL的生長激素劑量干預3T3-F442A前脂細胞誘導分化過程（對照用等體積PBS干預細胞），于分化不同時段(0-12天)收集RNA，檢測脂肪形成標志基因、脂肪合成相關(guān)酶類的表達水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.3T3-F442A脂肪前體細胞經(jīng)過體外誘導，細胞形態(tài)逐漸變圓，胞漿內(nèi)脂滴出現(xiàn)并逐漸變大增多，油紅O染色逐漸明顯，油紅O染

7、色萃取液的OD490nm值逐漸增大，誘導至第12天后可見90％以上細胞呈脂肪細胞表型、大量脂滴聚積，確定成功建立脂肪細胞誘導模型。
　　2.RT-PCR和Western Blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在脂肪細胞誘導分化過程中PPARγmRNA及蛋白質(zhì)表達水平隨分化程度的增強逐漸升高，與未分化細胞（誘導分化第0天）相比較，自誘導分化第4天始，在每個時間點皆呈明顯升高，且差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05）。C/EBPβ、FAS基因表達水平經(jīng)誘導

8、分化顯著升高。
　　3.Microarray分析結(jié)果表明:500 ng/mL生長激素處理成熟3T3-F442A脂細胞24 h后Adipor2及SOCS2兩個基因表達水平較對照組明顯上調(diào)。此結(jié)果為RT-PCR所證實。
　　4.與對照組(PBS組)細胞相比，成熟3T3-F442A脂肪細胞經(jīng)125 ng/mL生長激素分別處理24 h及48 h后，IGF-I mRNA表達水平均上調(diào);生長激素不改變Leptin的表達;SOCS家族CI

9、S、SOCS1、SOCS3受GH刺激24 h表達水平均升高，48 h后有所回調(diào);Adiporl在生長激素刺激24 h時表達升高2.5倍;說明生長激素可調(diào)節(jié)成熟3T3-F442A脂肪細胞內(nèi)一些分子的表達。
　　5.生長激素下調(diào)了成熟3T3-F442A脂肪細胞中FAS、FABP、PPARγ的表達水平，而不改變C/EBPβ基因的表達;也不改變脂肪分解相關(guān)基因HSL、ATGL、UCP1表達;提示GH影響脂肪細胞合成活動。
　　6.生

10、長激素對3T3-F442A前脂細胞分化過程的干預結(jié)果表明:脂肪合成標志基因及合成酶類表達受GH干預下調(diào)，但GH未能抑制脂肪細胞的分化，可見GH阻礙脂肪細胞分化程度但不改變分化進程。
　　研究結(jié)論:
　　1.3T3-F442A前體脂肪細胞可在體外誘導分化為成熟脂肪細胞，造模成功。
　　2.Microarray檢測結(jié)果表明生長激素在成熟脂肪細胞可提高SOCS家族及脂聯(lián)素受體的表達。
　　3.生長激素在3T3-F442

11、A脂肪前體細胞體外誘導分化過程中，發(fā)揮一定程度的抑制分化的作用，但無法阻止誘導分化進程。
　　第二部分、STAT5B分子在脂肪細胞分化中的作用研究
　　目的:探討shRNA敲低STAT5B的表達在前體脂肪細胞3T3-L1體外分化進程中作用。
　　研究內(nèi)容:
　　1.分別檢測STAT5A及STAT5B在3T3-L1脂肪前體細胞誘導分化過程中mRNA水平;
　　2.設計靶向小鼠STAT5B基因的shRNA序列，

12、構(gòu)建重組慢病毒載體LV3-STAT5B-shRNA，以慢病毒LV3-NC為陰性對照，經(jīng)293T細胞包裝病毒后感染脂肪前體細胞3T3-F442A，篩選出3T3-L1穩(wěn)轉(zhuǎn)STAT5B敲低(Knockdown)的細胞群(KD)及陰性對照單細胞群(NC);
　　3.對篩選所得穩(wěn)轉(zhuǎn)STAT5BKD細胞及NC細胞進行誘導分化，分別于分化不同時期提取RNA(D0，D2，D4，D6，D8，D10，D12)，檢測樣本中脂肪分化標志基因、脂肪合成相關(guān)

13、酶類及脂分解相關(guān)酶的mRNA水平;
　　4.在誘導培養(yǎng)基中添加125 ng/mL劑量的生長激素以干預KD及NC兩種穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞群的分化過程，在分化不同時段提取RNA，檢測樣本中脂肪分化標志基因、脂肪合成相關(guān)酶類及脂分解相關(guān)酶的mRNA水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.在脂肪細胞誘導分化過程中，STAT5A及STAT5B mRNA表達水平隨細胞分化程度的增強逐漸升高。與未分化前(D0)比較，3T3-L1前脂細胞誘導分化第2天S

14、TAT5B基因表達即明顯升高，且分化過程中穩(wěn)定表達。
　　2.對篩選出的STAT5BKD及NC3T3-L1脂肪前體單克隆細胞進行RT-PCR和Western Blot檢測，結(jié)果表明所選STAT5B-shRNA序列能夠有效干擾STAT5BmRNA及蛋白質(zhì)的表達，分別降低至30％及10％。
　　3.體外誘導分化實驗結(jié)果表明:干擾STAT5B表達降低了脂肪細胞分化標志基因的表達;與分化同期對照組細胞(NC)比較，敲低STAT5B表

15、達組細胞(KD)在誘導分化過程中PPARα、PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ等mRNA表達水平明顯下調(diào)(p＜0.05）。
　　4.體外誘導分化實驗結(jié)果還表明:與對照(NC)細胞比較，KD細胞脂肪合成相關(guān)酶類，如脂肪酸合成酶(FAS)、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)的表達水平下降。乙酰輔酶A羧化酶(ACC)表達兩組無明顯差異。
　　5.生長激素干預降低了KD及NC兩組細胞脂肪合成關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子及脂肪合成相關(guān)基因的表達水平，但

16、GH干預對NC組的蛋白表達所致之降低更為明顯。
　　6.生長激素干預在3T3-L1前脂細胞分化中上調(diào)了ATGL的表達;生長激素作用大幅上調(diào)了NC細胞中UCP1的表達，而未改變KD細胞中UCP1的表達。
　　研究結(jié)論:
　　1.在3T3-L1前體脂肪細胞的體外分化過程中，STAT5B呈現(xiàn)升高趨勢。
　　2.敲低3T3-L1前體脂肪細胞中STAT5B基因的表達，其分化過程中關(guān)鍵性酶及分子的表達水平受到影響。
　

17、　3.在前脂細胞分化過程中，因生長激素的干預作用使PPARα、PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、FAS及FABP六種與脂肪形成相關(guān)的基因表達下調(diào)。
　　4.在前脂細胞分化過程中，因生長激素的干預作用使得ATGL基因的表達上調(diào)，也使UCP1基因的表達大幅上調(diào)，這種上調(diào)在STAT5B敲低的細胞中未得到體現(xiàn)，提示這種表達上調(diào)是STAT5B依賴性的。
　　第三部分、胰島素/IGF-I對生長激素STAT5信號通路的影響研究

18、>　　目的:探討胰島素對生長激素在成熟3T3-F442A脂肪細胞中信號通路的影響
　　研究內(nèi)容:
　　1.以系列濃度(0、5、25、50、125 ng/mL)生長激素刺激3T3-F442A成熟脂肪細胞，檢測STAT5及MAPK信號的磷酸化程度;
　　2.以200 nM胰島素及100 ng/mL IGF-I刺激3T3-F442A成熟脂肪細胞模型，運用Western Blot技術(shù)檢測STAT5及MAPK信號通路的活化程度;

19、
　　3.用胰島素與系列濃度生長激素共同作用脂肪細胞10 min及胰島素預處理20min后再與系列濃度生長激素共同作用10 min，檢測胰島素對生長激素信號通路分子STAT5及MAPK磷酸化影響;
　　4.用IGF-I與生長激素共同作用分化成熟的脂肪細胞10 min及IGF-I預處理20min后再與生長激素共同作用10 min，檢測信號通路分子STAT5及MAPK磷酸化變化;
　　5.在C57/BL6小鼠腹腔體內(nèi)注射生

20、長激素及胰島素，取腎周脂肪組織提取蛋白質(zhì)，檢測動物脂肪中胰島素對生長激素信號分子STAT5及MAPK活化的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.在成熟3T3-F442A脂肪細胞中，生長激素誘導STAT5磷酸化水平及MAPK磷酸化水平與生長激素均呈劑量及作用時間效應關(guān)系。
　　2.胰島素或IGF-I刺激3T3-F442A脂肪細胞不誘導STAT5酪氨酸磷酸化;但可誘導MAPK的酪氨酸磷酸化。
　　3.細胞及動物實驗均表明:

21、胰島素可增強生長激素誘導的STAT5磷酸化水平，提示胰島素與生長激素共同作用可提高生長激素對STAT5活化的程度。
　　4.IGF-I也可增強生長激素誘導STAT5磷酸化水平，提示IGF-I有與胰島素類似的效應，即與生長激素共同作用而促進了STAT5的活化水平。
　　研究結(jié)論:
　　1.生長激素特異性活化3T3-F442A成熟脂肪細胞內(nèi)JAK-STAT5信號通路，而胰島素及IGF-I不引起此通路的活化;
　　2.

22、細胞及動物試驗均表明:胰島素增強了生長激素活化STAT5的程度，提示胰島素與生長激素可能在成熟脂肪細胞內(nèi)協(xié)同調(diào)節(jié)特定的生理功能。
　　3.IGF-I與胰島素有相近的信號通路，本課題發(fā)現(xiàn)IGF-I也可增強生長激素對STAT5信號通路的活化程度。
　　4.生長激素的STAT5途徑有利于抑制脂肪的積累，而胰島素則有利于前脂肪細胞的分化、脂肪的積累。我們的觀察表明，胰島素與生長激素共同存在時，可促進生長激素引發(fā)的STAT5途徑，這可