miR-17-5p對(duì)大鼠BMMSCs增殖周期的調(diào)控作用研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化,由此導(dǎo)致的血栓性疾病也成為全球健康的頭號(hào)殺手。其中冠心病(Coronary Heart Disease,CHD)的致死率約為13％左右,尤其是心肌梗死(Myocaridal Infarction,MI)的發(fā)生率呈上升趨勢(shì),嚴(yán)重威脅了人類的壽命和生活質(zhì)量。而目前對(duì)冠心病的治療方式均無法從根本上挽救已經(jīng)壞死的心肌。一般認(rèn)為,心肌細(xì)胞是終末期細(xì)胞,在心肌受到損害后無法自行修復(fù)

2、。如何挽救壞死的心肌細(xì)胞改善心臟功能成為當(dāng)今研究的重點(diǎn),近年來隨著對(duì)干細(xì)胞(Stem Cells)的研究發(fā)現(xiàn)將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞后可以修復(fù)梗死區(qū)域的壞死心肌并且能夠改善心功能,這一研究為終末期心臟病患者帶來了新的曙光。在干細(xì)胞中,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)以具有自我更新能力、多向分化潛能及易于獲得等特性而成為當(dāng)今干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。但是隨著對(duì)干細(xì)胞的研究的深

3、入,研究者們發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代時(shí)同其他體細(xì)胞一樣都存在著細(xì)胞衰老的現(xiàn)象,這一現(xiàn)象嚴(yán)重阻礙了干細(xì)胞的臨床應(yīng)用,因此如何解決這一問題成為醫(yī)學(xué)研究者共同的目標(biāo)。
　　研究目的：
　　1.探討大鼠BMMSCs體外分離培養(yǎng)、生長(zhǎng)與傳代并觀察各代BMMSCs的增殖規(guī)律和特點(diǎn)。
　　2.明確miR-17-5p在衰老及正常大鼠BMMSCs中的表達(dá)變化規(guī)律與差異性。
　　3.研究miR-17-5p對(duì)大鼠BMMSCs增殖周期的

4、影響和調(diào)控作用。
　　研究方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞計(jì)數(shù)與鑒定:采用差速貼壁法聯(lián)合密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BMMSCs,并傳代純化培養(yǎng)至第10代。取第4代(P4)至第10代(P10)BMMSCs用流式細(xì)胞儀分別進(jìn)行表面抗原CD29、CD44、CD45鑒定。倒置顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察各代細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化并記錄,將各代細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并繪制增殖曲線。
　　2.BMMSCs細(xì)胞衰老檢測(cè):取第4代(P4)BMMSCs至第10代(P1

5、0)BMMSCs用β-半乳糖苷酶(β-gal)染色法分別進(jìn)行染色,以檢測(cè)出衰老細(xì)胞。
　　3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與MTT法:將P10BMMSCs接種于24孔板中,分為空白對(duì)照組(P10-CON),轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組(P10-Xtrem)實(shí)驗(yàn)組(P10-mimics),每組細(xì)胞設(shè)有三個(gè)復(fù)孔,將miR-17-5p-mimics轉(zhuǎn)染入試驗(yàn)組中,于細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)48h后開始進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及MTT法檢測(cè),并繪制細(xì)胞增值曲線。
　　4.PCR技術(shù)及流式

6、細(xì)胞檢測(cè)技術(shù):采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)正常與衰老BMMSCs中miR-17-5p基因的表達(dá)情況及轉(zhuǎn)染48h后3組細(xì)胞中miR-17-5p的表達(dá)量,并用2(-ΔΔct)法定量分析。饑餓培養(yǎng)P10-CON組及P10-mimics組細(xì)胞,令其同時(shí)進(jìn)入細(xì)胞周期后,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞的細(xì)胞周期。
　　研究結(jié)果：
　　1.各代BMMSCs形態(tài)學(xué)變化:P4至P10的BMMSCs細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,P4BMMS

7、Cs形態(tài)均一,呈典型的漩渦狀生長(zhǎng),P10BMMSCs失去典型的梭形外觀,細(xì)胞體積增大而不規(guī)則,形狀扁平,細(xì)胞間隙增大,出現(xiàn)衰老現(xiàn)象。流式細(xì)胞儀檢測(cè)P4至P10BMMSCs表面標(biāo)志抗原CD44和CD45,結(jié)果顯示:各代BMMSCs的CD44陽性表達(dá)率90%以上,CD45陽性表達(dá)率為3%以下。
　　2.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及增殖規(guī)律:P4-P10BMMSCs及P10-mimics組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,均呈S形。第1、2d細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,為潛伏期;第3

8、-5天細(xì)胞增殖加速,數(shù)目呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)繁殖,為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;培養(yǎng)第6d細(xì)胞數(shù)目達(dá)峰值,增殖速度減慢進(jìn)入平臺(tái)期,細(xì)胞數(shù)目相對(duì)穩(wěn)定;P4-8BMMSCs增殖良好,P9-10BMMSCs增殖不良,第6天,P10最為顯著(P<0.05)。P10-mimics組在接種24h后細(xì)胞數(shù)量無明顯改變,細(xì)胞處于停滯期,在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),P10-mimics組生長(zhǎng)最快(P<0.05),P10-mimics組在第7d時(shí)細(xì)胞數(shù)量仍在繼續(xù)緩慢的增長(zhǎng)。
　　3.B

9、MMSCs細(xì)胞衰老檢測(cè):P9至P10BMMSCs經(jīng)β-gal半乳糖苷酶染色呈藍(lán)色(陽性),提示此時(shí)細(xì)胞為衰老細(xì)胞。P4至P8BMMSCs經(jīng)染色β-gal半乳糖苷酶染色后未著色(陰性),提示此時(shí)細(xì)胞為正常細(xì)胞。
　　4.BMMSCsmiR-17-5p基因的表達(dá)狀況:P4BMMSCsmiR-17-5p基因的表達(dá)量是(2.7784±0.1052)bp為P10BMMSCs中的6.5倍(P<0.01)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,P10-mimics

10、組miR-17-5p表達(dá)量是(1.32365±0.231)bp為P10-CON中的2.9倍(P<0.05)。
　　5.miR-17-5p對(duì)BMMSCs細(xì)胞周期的影響:饑餓培養(yǎng)48h后添加血清,3組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分比分別降低了P10-CON組53.16%、P10-Xtrem組50.64%和P10-mimics組51.47%,且三組之間無明顯差異(P>0.05);3組S期細(xì)胞均有升高,可見有G0/G1期細(xì)胞進(jìn)入S期,以P10-

11、mimics組最為顯著(P<0.05)。P10-mimics組細(xì)胞從G0/G1期順利進(jìn)入S期,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖;3組細(xì)胞從S期進(jìn)入G2期,以P10-mimics組最為顯著(P<0.05);3組細(xì)胞增殖指數(shù)分別為P10-CON組65.44%,P10-Xtrem組54.405%和P10-mimics組83.85%,P10-mimics組約為P10-CON組的1.28倍,(P<0.05),說明P10-mimics組的增殖能力強(qiáng)。
　　研

12、究結(jié)論：
　　1.利用差速貼壁聯(lián)合密度梯度離心的分離方法,能獲得較高純度的BMMSCs,通過檢測(cè)BMMSCs的表面抗原可以鑒定,BMMSCs在體外多次傳代的過程中可以保持較高的純度。
　　2.衰老BMMSCs中miR-17-5p的表達(dá)量顯著降低,提示miR-17-5p可能參與了細(xì)胞的衰老過程。
　　3.miR-17-5p能夠促使BMMSCs由G0/G1期進(jìn)入S期,改變細(xì)胞周期,從而提高細(xì)胞的增殖能力延緩細(xì)胞衰老狀態(tài)和進(jìn)