MiR-17-5p調控非創(chuàng)傷性股骨頭壞死骨髓基質干細胞成骨分化與增殖的相關研究.pdf

1、第一部分主要miRNA在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者和對照組患者骨髓基質干細胞中的表達差異研究
　　目的:觀察非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者與骨性關節(jié)炎患者骨髓基質干細胞中主要miRNA的表達差異，尋找在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死發(fā)病過程中起重要調節(jié)作用的miRNA。
　　方法:大量查閱文獻后找到參與調節(jié)骨髓基質干細胞成骨分化，成脂分化，增殖相關過程的主要備選miRNA10個，分別為：miR-20a，miR-17-5p，miR-27a-3p，mi

2、R-96-5p，miR-124-3p，miR-125b-5p，miR-133a，miR-143，miR-155-5p，miR-199a-5p。臨床上收集了20例非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者原代骨髓基質干細胞以及10例對照組患者原代骨髓基質干細胞，使用實時熒光定量RT-PCR方法檢測上述10個miRNA的在實驗組及對照組中的表達。
　　結果:miR-20a，miR-17-5p，miR-27a-3p，miR-125b-5p，miR-133a

3、，miR-143，miR-155-5p，miR-199a-5p在實驗組表達較對照組顯著降低，有統(tǒng)計學意義（p<0.05），miR-96-5p，miR-124-3p在對照組和實驗組間無明顯差異(p>0.05)。
　　結論:miR-20a，miR-17-5p，miR-27a-3p，miR-125b-5p，miR-133a，miR-143，miR-155-5p，miR-199a-5p可能通過靶向于不同的mRNA調節(jié)骨髓基質干細胞的分化與

4、增殖，在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死病理過程中起作用。
　　第二部分miR-17-5p調控SMAD7在HMSC-bm成骨分化過程中表達的研究
　　目的：miR-17-5p在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者MSC中表達水平顯著低于對照組，本部分實驗目的在于通過生物信息學預測與熒光素酶報告基因檢測找到并確定miR-17-5p的靶基因，并檢測其在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者MSC標本中的表達水平以及在HMSC-bm成骨分化過程中的表達水平變化規(guī)律。

5、　　方法：使用TargetScan6.2與Pictar網(wǎng)站進行miR-17-5p靶基因預測。實時定量PCR檢測第一部分中20個非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者MSC標本中SMAD7表達水平，以及其與miR-17-5p表達水平是否具有相關性。實時定量PCR檢測BMP-2誘導的HMSC-bm成骨分化過程中第0,1,2,4,6天miR-17-5p及SMAD7表達水平變化趨勢（與不加入BMP-2的對照組進行比較）。在HMSC-bm細胞中使用miR-17-

6、5p類似物與miR-17-5p抑制劑調整miR-17-5p表達水平，實時定量PCR檢測SMAD7表達水平，Western蛋白印跡試驗檢測Smad7濃度。采用熒光素酶報告基因檢測方法，檢測miR-17-5p與SMDA7是否具有調控關系。
　　結果： SMAD7通過生物信息學預測可能是miR-17-5p的靶基因，結合SMAD7的生理作用我們認為miR-17-5p可能通過靶向抑制SMAD7在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死病理過程中起調控作用。Rea

7、l-time PCR結果顯示在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者MSC標本中miR-17-5p與SMAD7表達水平呈負相關（R2=0.5440，p=0.0002）。在BMP-2誘導的HMSC-bm成骨分化過程中miR-17-5p的表達水平自誘導后第一天起顯著高于對照組（p<0.05），SMAD7的表達水平自誘導后第二天起顯著低于對照組（p<0.05）。miR-17-5p類似物組SMAD7表達水平與Smad7蛋白濃度顯著高于陰性對照組，miR-17-

8、5p抑制劑組SMAD7表達水平與Smad7蛋白濃度顯著低于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。熒光素酶報告基因檢測示miR-17-5p通過靶向抑制SMAD7下調其表達。結論： miR-17-5p通過不完全互補結合SMAD7的3’UTR端靶向抑制其表達，在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死發(fā)病過程及MSC成骨分化過程中發(fā)揮調控作用。
　　第三部分miR-17-5p促進HMSC-bm細胞增殖及成骨分化的機制研究
　　目的：研究miR

9、-17-5p提高HMSC-bm細胞系增殖與成骨分化的機制。
　　方法：在HMSC-bm細胞中轉染miR-17-5p類似物與miR-17-5p抑制劑調整miR-17-5p表達水平并設立陰性對照，轉染4小時后加入100ng/ml BMP-2進行成骨誘導。6天后實時定量PCR觀察RUNX2以及Ⅰ型膠原表達水平改變，通過ALP染色觀察HMSC-bm細胞內堿性磷酸酶表達強度，通過CCK-8試劑盒檢測細胞增殖的改變。為了證明HMSC-bm細胞

10、增殖及成骨分化增強是通過SMAD7表達水平下降而導致的，我們通過轉染pcDNA3.1-SMAD7人為提高SMAD7表達水平，觀察以上效應是否減弱及逆轉。
　　結果：在BMP-2誘導的HMSC-bm成骨分化過程中，轉染miR-17-5p類似物組RUNX2，COL1A1的表達水平顯著高于陰性對照組（p<0.05），堿性磷酸酶表達顯著高于對照組，細胞增殖顯著高于對照組（p<0.05）。轉染miR-17-5p抑制劑組RUNX2，Ⅰ型膠原的