多基因修飾組織工程骨中其基因表達時限的檢測.pdf

1、目的：基因工程和組織工程技術的不斷發(fā)展，為臨床骨缺損修復提供了更多的治療選擇，利用生物工程相關技術體外構建組織工程骨仍是目前研究的熱點。本實驗通過構建pEGFP/hVEGF165和pEGFP/hBMP2兩種真核表達質(zhì)粒，并分別和共同轉(zhuǎn)染至兔成骨細胞，再以兔脫蛋白骨（DPB）為支架，體外構建多基因修飾的組織工程骨，同時對組織工程骨中hVEGF165和hBMP2基因的表達情況進行檢測，探討兩種基因在體外表達的相互影響和基因表達的時限，為組織

2、工程骨植入體內(nèi)的最佳時間的選擇提供體外對照和相關的理論支持。 方法：1、以pET22-hVEGF165為模板，通過PCR方法擴增出hVEGF165基因，亞克隆至真核表達質(zhì)粒pEGFP-C1，成功構建重組質(zhì)粒pEGFP/hVEGF165，將質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hBMP2酶切出hBMP2片段后，同樣方法構建重組質(zhì)粒pEGFP/hBMP2，并對兩種質(zhì)粒分別進行酶切和測序鑒定。2、分離、培養(yǎng)出兔原代成骨細胞并進行傳代培養(yǎng)，對細胞

3、進行鏡下形態(tài)學觀察、細胞化學及酶學等鑒定，之后將細胞分為空白組（A組），pEGFP/hBMP2組（B組），pEGFP/hVEGF165組（C組），pEGFP/hVEGF165+pEGFP/ hBMP2組（D組），用脂質(zhì)體法將兩種質(zhì)粒按分組在體外分別轉(zhuǎn)染至成骨細胞，采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。3、將轉(zhuǎn)染后將各組細胞分別與DPB支架材料在體外復合培養(yǎng)，觀察細胞在各組支架上的生長情況，通過RT-PCR和Western Blot分別檢測各組hB

4、MP2和hVEGF165不同時段的表達情況。 結果：1、重組pEGFP/hBMP2和pEGFP/hVEGF165質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和測序鑒定正確。2、通過鏡下形態(tài)學觀察、細胞化學及酶學等鑒定，證實本實驗分離培養(yǎng)出的細胞為成骨細胞，轉(zhuǎn)染后除空白組外其余三組均可用熒光顯微鏡觀察到的綠色熒光。3、各組細胞在體外與DPB復合培養(yǎng)后，隨培養(yǎng)時間的延長，材料中細胞數(shù)量也隨之增多，RT-PCR結果顯示D組的hVEGF165 mRNA和hBMP2 m

5、RNA轉(zhuǎn)錄水平均高于其余三組，Western Blot結果顯示D組在各時間點的hVEGF165和hBMP2蛋白表達量均高于其他三組，其中hVEGF165蛋白表達最高峰在10日左右，hBMP2蛋白表達最高峰在7日左右。 結論：1、成功構建重組pEGFP/hBMP2和pEGFP/ hVEGF165質(zhì)粒。2、將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至成骨細胞，為下一步構建基因修飾的組織工程骨準備種子細胞。3、成功構建hVEGF165和hBMP2多基因修飾的組織工程