骨組織工程中一種轉基因生物緩釋體系的構建——rhBMP-2和rhVEGF基因修飾ADSCs的可行性研究.pdf

1、背景和目的： 骨組織工程為骨折和骨缺損完全再生修復提供了有效的解決方案。脂肪源性干細胞(ADSCs)以其容易獲得、體外擴增能力強并能定向誘導分化成骨而成為骨組織工程中理想的種子細胞。rhBMP-2和rhVEGF能夠有效的誘導刺激ADSCs成骨。但二者半衰期短，在單獨加入種植有ADSCs的支架材料回植入體內后，很快就會被擴散稀釋或酶解失效；而通過復合到微膠囊、明膠蛋白、纖維蛋白膠中隨之降解釋放，釋放速度或快或慢不易控制，都難以在新

2、骨形成的全過程中充分發(fā)揮誘導成骨的作用。因此需要在實際應用中找到一種安全可靠且持續(xù)穩(wěn)定誘導ADSCs成骨的細胞因子緩釋體系。 本課題擬運用基因修飾的方法，把對骨生成有影響的代表性生長因子rhBMP-2和rhVEGF的基因轉染到ADSCs中，然后從ADSCs生物學性狀的變化、BMP-2和VEGF基因的表達情況、以及該轉染體系的體內成骨效應三個方面來進行觀察。以期為ADSCs作為種子細胞的骨組織工程建立一個穩(wěn)定可靠的轉基因生物緩釋體

3、系。 方法： 采用改良的酶消化法從6月齡貴州小香豬的腹壁脂肪組織中獲得ADSCs。對ADSCs進行成脂、成骨定向誘導分化，波形蛋白檢測，擴增培養(yǎng)等干細胞特性鑒定。倒置顯微鏡下連續(xù)觀察傳代培養(yǎng)細胞的生長特性。 將通過轉化、篩選、擴增培養(yǎng)和抽提獲得的rhBMP-2和rhVEGF純化質粒，分別以脂質體LipofectamineTM2000介導的方式轉染第四代穩(wěn)定生長的ADSCs。轉染后48小時進行G418篩選，得到的陽

4、性克隆細胞進行擴大培養(yǎng)并傳代。用細胞消化計數(shù)法和四唑鹽比色法(MTT)對rhBMP-2和rhVEGF轉染前后相對應生長代數(shù)的ADSCs生長增殖情況進行比較，計算倍增時間，繪制生長曲線。觀察轉染后的細胞傳代培養(yǎng)的生長情況和形態(tài)學變化。 以RT-PCR和SABC免疫細胞化學法在轉錄和蛋白質水平觀察rhBMP-2和rhVEGF基因在轉染后48小時和第4周的表達情況。 建立小香豬自體前肢尺骨中段1.5cm骨缺損模型，根據(jù)不同的修

5、復方式將動物分三個實驗組：(A組)轉染rhBMP-2和rhVEGF基因的ADSCs與脫細胞骨基質材料(ACBM)復合而成的新型組織工程骨植入治療組；(B組)正常的ADSCs復合ACBM植入治療組；(C組)單純骨缺損未處理組。手術后第1、2、4、12周以x線以及第4周、12周取病理標本進行脫鈣骨組織切片染色觀察評價其成骨修復效果。 結果： 脂肪組織通過改良酶消化法消化后獲得的細胞，經過體外成骨和成脂誘導14天后，Gomor

6、i改良鈣鈷染色、VonKossa染色和油紅O染色結果均為陽性；波形蛋白免疫細胞化學結果表明其為中胚層來源；且該細胞能在體外進行大量的擴增。由此可證明分離培養(yǎng)的細胞為ADSCs。 傳代培養(yǎng)的ADSCs于第4～6代時生長狀態(tài)趨于穩(wěn)定。細胞形態(tài)由多角形、圓形和不規(guī)則形，逐漸向成纖維細胞樣和梭形過渡。rhBMP-2和rhVEGF轉染后ADSCs的群體倍增時間有所增加，但統(tǒng)計結果顯示轉染對ADSCs的生長增殖無明顯影響(P＞0.05)。轉

7、染后的細胞仍可具有擴增能力。轉染后連續(xù)傳代三代的細胞中未有明顯的異常表型和增生。 rhBMP-2和rhVEGF轉染ADSCs后的RT-PCR和SABC免疫細胞化學法結果均為陽性。顯示出rhBMP-2和rhVEGF在轉染ADSCs后48小時和四周時在轉錄和蛋白質水平都可表達BMP-2和VEGF。 動物骨缺損修復實驗中，前兩周內三組動物均未出現(xiàn)明顯的感染；連續(xù)X線觀察和骨切片顯示：A組在術后第三月已完全修復，且修復效果和進程

8、明顯優(yōu)于B組，C組缺損則主要由纖維結締充填，而僅在斷端兩側附近有少量成骨修復。 結論： 改良酶消化法可有效地從脂肪組織獲得具有定向誘導分化的ADSCs。這些ADSCs在體外培養(yǎng)至4～6代時可獲得較穩(wěn)定狀態(tài)。ADSCs作為宿主細胞被轉染外源性rhBMP-2和rhVEGF基因后未發(fā)生畸變及生長增殖的明顯改變，轉染ADSCs后rhBMP-2及rhVEGF基因可獲得四周內穩(wěn)定的表達。說明rhBMP-2和rhVEGF基因修飾的AD