VEGF及BMP2基因修飾對(duì)血管化組織工程骨的影響及機(jī)制研究.pdf

1、頜面部骨缺損常見于腫瘤切除、頜骨骨髓炎術(shù)后及頜面部外傷等疾患，近年來，我國由上述原因?qū)е碌墓侨睋p患者數(shù)量呈逐年上升趨勢(shì)。揭示骨缺損修復(fù)的機(jī)制，尋找骨缺損良好修復(fù)的方法是骨缺損修復(fù)研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。早期的自體骨移植、異體骨移植等傳統(tǒng)修復(fù)骨缺損的方法對(duì)機(jī)體損傷較大且效果不佳;之后人工合成的骨替代物因生物相容性差、體內(nèi)降解慢及機(jī)械性能低等不足沒有廣泛推廣;近些年骨組織工程骨的出現(xiàn)為頜骨缺損的修復(fù)帶來新希望。骨組織工程技術(shù)改變了以往創(chuàng)

2、傷性修復(fù)的模式，以少量組織細(xì)胞修復(fù)大面積組織缺損，并可根據(jù)需要進(jìn)行塑形恢復(fù)缺損形態(tài)，為實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)修復(fù)及良好的生物功能重建提供了理論基礎(chǔ)為骨再生修復(fù)指明了新的方向。骨組織工程主要包括種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子及載體支架三個(gè)要素。種子細(xì)胞是骨組織工程的首要環(huán)節(jié)和基本要素，其目的是使所構(gòu)建的組織工程骨兼具骨傳導(dǎo)性及骨誘導(dǎo)性，從而更好的修復(fù)骨缺損。所以選擇最優(yōu)的種子細(xì)胞成為骨組織工程首要解決的問題。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowstromalcel

3、ls，BMSCs)具有較強(qiáng)的多向分化能力，在一定條件下可分化為骨、軟骨、脂肪等細(xì)胞，BMSCs也因此成為骨組織工程中應(yīng)用最廣泛的種子細(xì)胞。骨形成蛋白2(Bonemorphogeneticprotein2，BMP2)具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)骨形成能力，將因子直接應(yīng)用于體內(nèi)由于彌散作用及其半衰期短的原因成骨效果不佳。研究發(fā)現(xiàn)采用基因修飾的方式可彌補(bǔ)因子直接應(yīng)用的不足，所以將BMP2與BMSCs聯(lián)合應(yīng)用的方法可為骨組織工程提供新型種子細(xì)胞。
　　

4、 以種子細(xì)胞復(fù)合生物材料的方法修復(fù)骨缺損雖然取得了一定的成功，但一些較大面積的骨缺損因植入物缺少充足的血供而發(fā)生壞死。因此，有效的血管化已與種子細(xì)胞、支架材料及生長(zhǎng)因子共同列入骨組織工程的重要因素。預(yù)成血管植入是使骨替代物血管化最直接有效的方法，即將血管預(yù)先植入骨替代物中，利用顯微外科技術(shù)將其與宿主體內(nèi)血管吻合。此種方法可建造獨(dú)立的血管系統(tǒng)，為植入物提供豐富的血供，可達(dá)到良好的血管化效果。但是由于經(jīng)歷多次手術(shù)、損傷供血管區(qū)及治療周期長(zhǎng)

5、等不足使此方法局限于小面積骨缺損及軟組織創(chuàng)傷的修復(fù);誘導(dǎo)血管生成的因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblastgrowthfactor，F(xiàn)GF)、血管緊張素(Angiopoietin，Ang)的使用可促進(jìn)血管生成，但因半衰期短局部直接應(yīng)用效果欠佳。目前將具有血管形成能力的細(xì)胞與成骨性細(xì)胞的聯(lián)合應(yīng)用是血管化組織工程骨最有前景的方法之一，尤為血管

6、內(nèi)皮前體細(xì)胞(EndothelialProgenitorCells，EPCs)的出現(xiàn)，證明血管發(fā)生也存在于發(fā)育成熟后的機(jī)體組織打破了血管形成的傳統(tǒng)理念，為缺血性疾病提供了新思路。EPCs是一種未成熟細(xì)胞，可分化為內(nèi)皮細(xì)胞直接參與血管形成，在后肢缺血、心肌缺血及角膜損傷等動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究中取得了一定的成功。但EPCs的細(xì)胞數(shù)量有限，不足以用于大面積缺血缺損的修復(fù)。VEGF基因修飾EPCs可彌補(bǔ)其數(shù)量不足的缺點(diǎn)，因?yàn)閂EGF不僅可以募集、

7、趨化EPCs至缺損處，其本身也可直接誘導(dǎo)血管生成。因此，VEGF與EPCs聯(lián)合應(yīng)用應(yīng)該能夠達(dá)到事半功倍的效果。基于此，本實(shí)驗(yàn)選擇具有血管形成能力的細(xì)胞與成骨性細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用的方法促進(jìn)組織工程骨血管化，觀察血管及骨形成情況，探討VEGF-EPC與BMP2-BMSC聯(lián)合應(yīng)用對(duì)血管化及成骨作用的影響。
　　 主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果:
　　 1.BMSCs的分離及鑒定:將密度梯度離心法分離的大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞通過塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)、體外擴(kuò)

8、增傳代進(jìn)行分離純化獲得較高純度的BMSCs。分別將BMSCs培養(yǎng)于成骨誘導(dǎo)液及成脂誘導(dǎo)液中，茜素紅染色及油紅O染色證明BMSCs可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞，通過細(xì)胞功能檢測(cè)鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。
　　 2.EPCs的分離及鑒定:采用密度梯度離心法分離大鼠骨髓的單個(gè)核細(xì)胞，通過特殊培養(yǎng)基誘導(dǎo)，貼壁培養(yǎng)、體外擴(kuò)增純化獲取細(xì)胞，利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表型檢測(cè)及細(xì)胞免疫雙熒光、體外成管實(shí)驗(yàn)等細(xì)胞功能檢測(cè)進(jìn)行鑒定，結(jié)果證實(shí)此種方

9、法分離誘導(dǎo)純化的細(xì)胞為EPCs。同時(shí)將BMSCs及EPCs以不同比例混合培養(yǎng)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，確定BMSCs∶EPCs的最佳混合比例為1∶1。
　　 3.Ad-BMP2及Ad-VEGF腺病毒載體的構(gòu)建及有效性鑒定:體外構(gòu)建Ad-BMP2及Ad-VEGF腺病毒載體，利用AdMax包裝系統(tǒng)對(duì)其包裝、純化，鑒定重組病毒載體攜帶目的基因的正確性。
　　 3.1.測(cè)定Ad-BMP2的滴度為2.3×1011pfu/ml，

10、Ad-VEGF滴度為3×1011pfu/ml;設(shè)置MOI梯度將Ad-BMP2、Ad-VEGF分別轉(zhuǎn)染BMSCs、EPCs，通過對(duì)綠色熒光表達(dá)的觀察確定病毒轉(zhuǎn)染的最佳MOI值為40，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線證明在MOI=40時(shí)細(xì)胞的增殖能力沒有受到影響;
　　 3.2.提取重組腺病毒轉(zhuǎn)染組、空白病毒轉(zhuǎn)染組及空白細(xì)胞組的RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示在RNA水平Ad-BMP2-BMSCs組BMP2及Ad-VEGF-EPCs組VEGF的表達(dá)

11、顯著高于各自對(duì)照組(p＜0.05);分別收集各組細(xì)胞上清，Elisa檢測(cè)BMP2、VEGF蛋白水平的表達(dá)，Ad-BMP2-BMSCs組BMP2及Ad-VEGF-EPCs組VEGF的表達(dá)顯著高于各自對(duì)照組(p＜0.05);證明了Ad-BMP2及Ad-VEGF腺病毒載體構(gòu)建的有效性。
　　 4.VEGF修飾的EPCs對(duì)BMP2-BMSC體外成骨分化的影響:將細(xì)胞分為BMSC+EPC、Ad-BMP2-BMSC+EPC、BMSC+Ad-

12、VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC四組，體外行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于7d、14d、21d及28d行成骨能力檢測(cè)。
　　 4.1茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié):結(jié)果顯示各組礦化結(jié)節(jié)數(shù)目隨時(shí)間增加而增多，在第21d及28d，BMP2轉(zhuǎn)染組Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+EPC礦化結(jié)節(jié)數(shù)目顯著高于其他組（p＜0.05）;兩組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)目在21、28天的變化不明顯;

13、r>　　 4.2ALP活性檢測(cè):隨時(shí)間增加每組細(xì)胞的ALP活性逐漸增強(qiáng)，誘導(dǎo)后第21天各組ALP活性均達(dá)最高值，且BMP2轉(zhuǎn)染組Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+EPC的ALP活性顯著高于其他組(p＜0.05);但在第28天發(fā)現(xiàn)各組間的差異減小，且Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+EPC的ALP活性較21d變化微小;
　　 4.3實(shí)時(shí)定量PCR

14、檢測(cè)ALP、OC、ColⅠ成骨基因表達(dá):Ad-BMP2-BMSC+EPC、BMSC+Ad-VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC組中ALP基因的表達(dá)在誘導(dǎo)后第21天達(dá)到高峰，其中Ad-BMP2-BMSC+EPC組和Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC組ALP的表達(dá)顯著高于其他各組(P＜0.05)，每組的OC表達(dá)隨時(shí)間變化增長(zhǎng)緩慢，組間沒有顯著差異;隨時(shí)間變化各組的ColⅠ表達(dá)逐漸增多，21天時(shí)達(dá)到

15、高點(diǎn)，且Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC組ColⅠ表達(dá)水平高于其他各組（P＜0.05）。
　　 5.VEGF修飾的EPCs對(duì)組織工程骨形成及血管化的影響:將BMSC+EPC、Ad-BMP2-BMSC+EPC、BMSC+Ad-VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC四組細(xì)胞分別與藻酸鹽凝膠混合注入大鼠股骨外側(cè)肌袋內(nèi)，每組5只大鼠，分別于4w及6w將動(dòng)物處死取出植入組織，免疫染色檢測(cè)骨、Co

16、lⅠ及血管形成。
　　 5.1石蠟包埋后切片行HE染色檢測(cè)新生組織中骨生成情況，結(jié)果顯示混合物注入4周后組織切片HE染色可見藻酸鹽凝膠材料數(shù)量減少，長(zhǎng)圓形、梭形細(xì)胞圍繞凝膠材料周圍;第6周，HE染色仍可觀察到材料的殘余，能夠見到細(xì)胞核深染的成骨細(xì)胞形成。實(shí)驗(yàn)中未見有炎癥反應(yīng)發(fā)生。定量分析骨形成面積:在第4周和第6周，Ad-BMP2-BMSC+EPC及Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC組新骨形成面積顯著高于其他兩組(

17、P＜0.05）;第6周，Ad-BMP2-BMSC+EPC及Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC組組間有顯著差異（P＜0.05），但Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+EPC組新骨形成面積相對(duì)第4周增長(zhǎng)緩慢;
　　 5.2天狼猩紅染色檢測(cè)ColⅠ生成情況:可觀察到新膠原組織產(chǎn)生，并間雜有不規(guī)則狀的未成熟骨樣基質(zhì)。隨時(shí)間增長(zhǎng)，新生膠原組織數(shù)量增加。第4及第6周，Ad-BMP2-BM

18、SC+EPC及Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC組新膠原形成面積顯著高于其他兩組（P＜0.05）;
　　 5.3血管內(nèi)皮特殊標(biāo)記物CD31檢測(cè)新生物中血管的生成情況，第4及第6周，BMSC+Ad-VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC兩組血管生成數(shù)目顯著高于其他兩組(P＜0.05)，且兩組間存在顯著差異Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC組的血管生成數(shù)量顯著高于BMSC+Ad

19、-VEGF-EPC組(P＜0.05)。
　　 6.BMP2及VEGF對(duì)Id1表達(dá)的影響:分別提取Ad-BMP2-BMSC組、Ad-VEGF-EPC組、空白病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組及空白細(xì)胞組的RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Ad-BMP2-BMSC組及Ad-VEGF-EPC組Id1基因RNA水平的表達(dá)顯著高于各自對(duì)照組（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1.密度梯度離心法分離大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，通過不同的誘導(dǎo)方式對(duì)其進(jìn)行分離

20、、誘導(dǎo)及純化可分別得到純度較好的BMSCs及EPCs。
　　 2.通過細(xì)胞功能鑒定證明EPCs具有血管形成能力及BMSCs具有成骨分化能力。
　　 3.體外構(gòu)建Ad-BMP2及Ad-VEGF重組腺病毒表達(dá)載體，滴度高轉(zhuǎn)染效率好，可使BMSCs過表達(dá)BMP2及EPCs高表達(dá)VEGF，可有效促進(jìn)BMSCs的成骨性能及EPCs的血管形成活性。
　　 4.VEGF修飾的EPCs與BMP2修飾的BMSCs聯(lián)合應(yīng)用，可通過細(xì)

21、胞間因子交流有效促進(jìn)血管的形成，VEGF修飾的EPCs為理想的促血管生成種子細(xì)胞。
　　 5.BMP2及VEGF誘導(dǎo)Id1的表達(dá)升高對(duì)成骨細(xì)胞終末分化的抑制作用可能會(huì)導(dǎo)致骨形成不佳，且Id1可通過募集趨化EPCs促進(jìn)血管生成;由此推測(cè)Id1可能為成骨分化及血管形成的重要分子。Id1在骨形成及血管形成中的作用為骨組織工程的研究提供了新思路。
　　 創(chuàng)新性和意義:
　　 1.本研究的創(chuàng)新點(diǎn)是在國內(nèi)外首次將BMP修飾的