BMP2和VEGF基因共修飾的骨髓基質干細胞在低氧條件下成骨能力研究.pdf

1、目的:
　　 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Protein2,BMP2)是目前已知的具有最強促進異位成骨能力細胞因子,血管內皮生長因子(Vascular endothelial growthfactor,VEGF)能顯著促進血管再生有利于骨缺損的愈合。BMP2和VEGF兩種蛋白的分泌存在相互促進的正反饋作用。骨缺損的愈合,尤其是在愈合過程的初期,是在低氧環(huán)境下進行的。骨髓基質干細胞(Bone Marrow

2、 Stromal Cells,BMSC)具有向骨形成細胞和血管形成細胞等多種細胞分化的潛能。本課題研究模擬低氧環(huán)境下同時轉染hBMP2和VEGF基因的BMSC在成骨方面的相關特性。
　　 方法:
　　 1.大鼠骨髓基質干細胞(BMSC)的分離、培養(yǎng)
　　 利用Percoll分離液(相對密度1.077),用密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離骨髓基質干細胞,進行體外培養(yǎng)及擴增。
　　 2.通過形態(tài)學觀察和生長曲線

3、的測定及Elisa,觀察BMSC轉染hBMP-2的腺病毒載體(Ad-hBMP-2)和VEGF的腺病毒載體(Ad-VEGF)后生物學行為的變化和目的基因的表達。
　　 BMSC轉染綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的腺病毒載體(Ad-GFP)后,使用熒光顯微鏡來測定腺病毒的轉染效率,并觀測轉染Ad-GFP的細胞傳代后綠色熒光蛋白的表達情況。
　　 3.MTT法檢測低氧控制系統(tǒng)下,轉染

4、Ad-hBMP-2和VEGF的BMSC細胞增值及活力
　　 取第二代骨髓基質干細胞進行實驗,實驗分為四組:(1)BMSC培養(yǎng)組;(2)Ad-hBMP-2+BMSC培養(yǎng)組;(3)VEGF+BMSC培養(yǎng)組;(4)Ad-hBMP-2+VEGF+BMSC培養(yǎng)組。體外連續(xù)培養(yǎng)7天,分別在此期間內用MTT法檢測各組細胞的增值能力,酶標儀測定光密度值(OD值),每個樣本設六個復孔,求其平均值并繪制細胞生長曲線。
　　 4.低氧控制系統(tǒng)

5、下,檢測轉染Ad-hBMP-2和VEGF的BMSC成骨能力
　　 取第二代骨髓基質干細胞進行實驗,實驗分為四組:(1)BMSC培養(yǎng)組;(2)Ad-hBMP-2+BMSC培養(yǎng)組;(3)VEGF+BMSC培養(yǎng)組;(4)Ad-hBMP-2+VEGF+BMSC培養(yǎng)組。96孔板內于低氧控制系統(tǒng)下,連續(xù)誘導培養(yǎng)6天,分別在此6天內用PNPP法檢測各組細胞的堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)的活性的表達:酶標儀測定

6、光密度值(OD值),每個樣本設五個復孔,求其平均值,并繪制ALP活性增長曲線;6孔板內四組樣本體外連續(xù)誘導培養(yǎng)7天,在第7天行茜素紅染色,觀察礦化結節(jié)形成情況。
　　 結果:
　　 1.密度梯度離心法,可獲取高純度的BMSC,并且細胞活性較好。貼壁3天后細胞成長為梭形及多角形,5、6天后增殖迅速,形成細胞集落。傳代后細胞形態(tài)更加單一,5、6天后即可鋪滿瓶底。
　　 2.體外實驗轉染骨髓基質干細胞。Ad-GFP轉染

7、12小時后即可檢測到綠色熒光蛋白表達,轉染2天后平均轉染效率為90％,傳至5代后依然可檢測到綠色熒光蛋白表達。
　　 3.MTT法檢測低氧控制系統(tǒng)下,轉染Ad-hBMP-2和Ad-VEGF的BMSC細胞增值及活力顯示:第1、2天各組細胞數(shù)量沒有明顯增加,各組間細胞增殖能力統(tǒng)計學上沒有顯著性差異(P＞0.05);第3天后,各組細胞數(shù)量明顯增加,轉染Ad-hBMP-2的細胞增殖能力在統(tǒng)計學上顯著高于其他培養(yǎng)組(P＜0.01),轉染A

8、d-VEGF細胞增殖能力與空白組無顯著性差別(P＞0.05)。
　　 4.低氧控制系統(tǒng)下,檢測轉染Ad-hBMP-2和VEGF的BMSC成骨能力
　　 1)PNPP法檢測各組ALP活性表達,結果顯示:Ad-hBMP-2+VEGF+BMSC培養(yǎng)組細胞成骨誘導培養(yǎng)后,ALP活性表達統(tǒng)計學上顯著高于其他三組(P＜0.05);Ad-hBMP-2+BMSC成骨誘導培養(yǎng)組高于BMSC組和VEGF+BMSC組(P＜0.05);BMSC

9、組和VEGF+BMSC組無顯著差別(P＜0.05)。
　　 2)低氧控制系統(tǒng)下,4組樣本培養(yǎng)7天后,茜素紅染色結果顯示:Ad-hBMP-2+VEGF+BMSC成骨誘導培養(yǎng)組細胞密集生長區(qū)有多量礦化結節(jié)形成,茜素紅染色成橘紅色。Ad-hBMP-2+BMSC和VEGF+BMSC成骨誘導培養(yǎng)組細胞有少量礦化結節(jié)。BMSC成骨誘導培養(yǎng)組只有零星幾個礦化結節(jié)。
　　 結論:
　　 在一周的培養(yǎng)時間內,骨形態(tài)形成蛋白(Bon