rhBMP-2緩釋體對(duì)鉻顆粒誘導(dǎo)的溶骨效應(yīng)的影響.pdf

1、研究背景:
　　 人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是目前治療晚期骨關(guān)節(jié)疾病的有效方法，其能有效的解除關(guān)節(jié)疼痛、恢復(fù)關(guān)節(jié)活動(dòng)功能，提高患者生活質(zhì)量。目前全世界每年超過(guò)200萬(wàn)人接受人工關(guān)節(jié)置換術(shù)，其中行翻修手術(shù)者達(dá)到了20％左右。關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染、假體無(wú)菌性松動(dòng)、假體周?chē)钦?、關(guān)節(jié)不穩(wěn)定和關(guān)節(jié)活動(dòng)受限等是關(guān)節(jié)置換術(shù)后需要翻修的常見(jiàn)原因。其中關(guān)節(jié)假體周?chē)侨芙庖鸬募袤w無(wú)菌性松動(dòng)(asepticloosening)是影響人工關(guān)節(jié)使用壽命的主要原因之一

2、。隨著關(guān)節(jié)置換術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用以及時(shí)間的推移，關(guān)節(jié)置換術(shù)后翻修的患者越來(lái)越多，假體周?chē)侨芙庖鸬募袤w無(wú)菌性松動(dòng)作為影響人工關(guān)節(jié)使用壽命的主要原因之一，其越來(lái)越受到關(guān)注。假體無(wú)菌性松動(dòng)晚期患者，為解除疼痛和提高生活質(zhì)量，必須行關(guān)節(jié)翻修手術(shù)。患者要面對(duì)難度大、風(fēng)險(xiǎn)高及費(fèi)用多等問(wèn)題。如何能找到一種非手術(shù)方法來(lái)預(yù)防和治療假體周?chē)侨芙庖殉蔀榉浅Ｆ惹泻同F(xiàn)實(shí)的問(wèn)題。
　　 骨組織正常結(jié)構(gòu)功能的維持是個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，這一平衡由骨形成代謝

3、和骨吸收代謝組成，一定量骨吸收后會(huì)有等量的骨形成。RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)是破骨細(xì)胞分化、激活和凋亡過(guò)程中的一個(gè)重要信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，這一系統(tǒng)不僅參與調(diào)節(jié)生理性骨重建，也與病理狀態(tài)下多種骨病的發(fā)生密切相關(guān)。核因子κB受體活化因子配體(recetoractivatorofnuclearfactorκBligand，RANKL)與核因子κB受體活化因子(recetoractivatorofnuclearfactorκB，RANK)相結(jié)合

4、，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，促進(jìn)溶骨。骨保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG)可抑制RANKL的作用，抑制破骨細(xì)胞活化，促進(jìn)成骨。成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞在生理狀態(tài)下表達(dá)一定量的RANKL，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和骨吸收，同時(shí)又分泌相應(yīng)數(shù)量的OPG，防止骨的過(guò)度吸收，因此RANKL/OPG的比例協(xié)調(diào)是維持局部骨代謝平衡的關(guān)鍵。RANKL/OPG的比例或者RANK信號(hào)的失衡成為了許多骨骼疾病的病理基礎(chǔ)，表現(xiàn)為過(guò)度骨丟失、過(guò)度骨形成或者骨的重建

5、紊亂。由此可見(jiàn)，RANKL和OPG對(duì)骨吸收是同樣重要的因子，RANKL和OPG的平衡失調(diào)是導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化、出現(xiàn)骨溶解、骨量丟失的關(guān)鍵性因素。所以假體周?chē)墙M織中RANKL/OPG的平衡情況可反映假體周?chē)谴x情況。
　　 人工關(guān)節(jié)界面之間由于長(zhǎng)期的運(yùn)動(dòng)摩擦可產(chǎn)生聚乙烯、骨水泥和金屬等顆粒。這些磨損顆可釋放許多溶骨因子，如:白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，這些溶骨因子可刺激破

6、骨細(xì)胞的前體細(xì)胞RANKL基因的表達(dá)，同時(shí)抑制OPG的產(chǎn)量，引起假體周?chē)墙M織中的RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)平衡失調(diào)，RANKL/OPG的比值增加，實(shí)現(xiàn)破骨細(xì)胞的分化與活化，促進(jìn)假體周?chē)乒羌?xì)胞增殖、減少成骨細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)分泌，造成假體周?chē)芄窃黾?、成骨減少，最終導(dǎo)致假體無(wú)菌性松動(dòng)。由此可見(jiàn)，消除和逆轉(zhuǎn)RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)中的RANKL/OPG的比值失衡，可能是治療假體無(wú)菌性松動(dòng)的靶點(diǎn)。
　　 骨形態(tài)發(fā)生

7、蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMP）是目前促進(jìn)成骨作用最強(qiáng)的物質(zhì)，能誘導(dǎo)細(xì)胞向骨及軟骨方向轉(zhuǎn)化。BMP屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowthfactor，TGF)-β超家族成員，超過(guò)40種BMP已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，其中BMP-2有最高的成骨活性，是體內(nèi)成骨重要的促進(jìn)因子，能跨種誘導(dǎo)未分化間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向增殖和分化，促進(jìn)成骨。BMP-2調(diào)控骨代謝過(guò)程中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化、增殖與功能活性，

8、并通過(guò)自分泌、旁分泌和細(xì)胞黏附方式在細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)之間傳導(dǎo)信息，調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的分化和增殖，在骨重建中發(fā)揮重要作用。BMP-2的具體作用途徑是:BMP-2在細(xì)胞外通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞內(nèi)部和抑制性smad蛋白結(jié)合，使抑制性smad蛋白表達(dá)上調(diào)，這些smad蛋白經(jīng)磷酸化后轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)，調(diào)控目的基因與其他轉(zhuǎn)錄因子（包含PEBP2-α/Cbfa1)，與BMP-2激動(dòng)的smad蛋白協(xié)調(diào)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表型相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化與增殖。BMP-2參

9、與了骨代謝的各個(gè)階段，誘導(dǎo)骨內(nèi)、外膜和骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化為骨母細(xì)胞，加強(qiáng)了骨床再生能力，同時(shí)活化或誘導(dǎo)血管周?chē)拈g充質(zhì)細(xì)胞分化為軟骨和成骨細(xì)胞，是骨代謝過(guò)程中重要的骨形成因子。近年來(lái)關(guān)于BMP-2作用的研究越來(lái)越多，其在骨代謝過(guò)程中的的調(diào)節(jié)作用越來(lái)越受到重視，BMP-2可能是臨床防治金屬磨損顆粒引起假體無(wú)菌性松動(dòng)的有效方法。
　　 本文通過(guò)金屬磨損顆粒誘導(dǎo)產(chǎn)生模擬假體無(wú)菌性松動(dòng)的大鼠植骨氣囊模型，對(duì)大鼠植骨氣囊模型囊腔內(nèi)骨片行TR

10、AP染色，用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)測(cè)定骨片破骨細(xì)胞染色面積比率，評(píng)估骨片中的骨吸收情況;用Western-blot和RT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)骨片中RANKL、OPG的表達(dá)情況，評(píng)估骨片中的骨代謝情況;評(píng)價(jià)rhBMP-2對(duì)模型中骨片的骨吸收情況及RANKL、OPG表達(dá)的影響，探究rhBMP-2在防治假體無(wú)菌性松動(dòng)方面的作用。為假體無(wú)菌性松動(dòng)的防治探索一種新的方法。
　　 目的:
　　 1.通過(guò)構(gòu)建大鼠植骨氣囊模型和進(jìn)行不同濃度

11、的rhBMP-2緩釋體干預(yù)，觀察不同濃度rhBMP-2緩釋體對(duì)氣囊內(nèi)組織的骨吸收情況及RANKL、OPG表達(dá)的影響，評(píng)估rhBMP-2在動(dòng)物模型中的抗骨溶解作用。
　　 2.初步探討rhBMP-2在防治假體無(wú)菌性松動(dòng)方面的意義及可行性。
　　 方法:
　　 在實(shí)驗(yàn)用的60只SD大鼠中，選取50只（剩余10只作為周?chē)仪粌?nèi)骨片供體），隨機(jī)分成5組（空白組、鉻顆粒組、50μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組、10

12、0μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組和200μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組），在大鼠腹背部注入過(guò)濾后的空氣20ml，每2天1次，共3次，構(gòu)建氣囊。1周后，如注射部位無(wú)紅腫、流膿、硬結(jié)及滲出等明顯炎癥反應(yīng)，則表示動(dòng)物氣囊模型構(gòu)建成功。處死另外10只大鼠，取顱骨片，將骨片修整成為約10mmX10mm大小，去除干凈周?chē)浗M織并注意保護(hù)骨片表面骨膜。對(duì)氣囊模型構(gòu)建成功的大鼠行腹腔麻醉，麻醉成功后，將修整好的骨片植入氣囊中。在植骨

13、氣囊模型構(gòu)建成功24小時(shí)后，空白組的大鼠氣囊內(nèi)注入6ml生理鹽水，鉻顆粒組的大鼠氣囊內(nèi)注入2ml鉻顆粒懸液和4ml生理鹽水，50μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組、100μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組、200μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組的大鼠氣囊內(nèi)除均注入2ml鉻顆粒懸液外，還相應(yīng)的分別注入超聲分散后的50μg/ml、100μg/ml、200μg/mlrhBMP-2緩釋體懸液4ml。正常飼養(yǎng)2周后，處死動(dòng)物，

14、取囊腔組織。對(duì)囊腔內(nèi)骨片行TRAP染色，采用Imageproplus5.0軟件測(cè)量骨片破骨細(xì)胞染色面積比率;用Wester-blot檢測(cè)方法檢測(cè)囊腔內(nèi)組織的RANKL、OPG的表達(dá)情況;用Rt-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)囊腔內(nèi)組織的RANKmRNA、OPGmRNA的表達(dá)情況;記錄各組的相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，采用SPSS13.0軟件行One-WayANOVA，比較各組均數(shù)，以P＜0.05表示有顯著性差異，評(píng)估rhBMP-2緩釋體對(duì)囊腔內(nèi)骨片的骨代謝的影響

15、。
　　 結(jié)果:
　　 1.囊腔內(nèi)組織RANKL、OPG的Wester-blot檢測(cè)結(jié)果提示:RANKL、OPG在各組動(dòng)物模型囊腔組織中均有表達(dá)。在鉻顆粒組囊腔組織中的RANKL、OPG表達(dá)及RANKL/OPG值均明顯高于其他4組(均P＜0.05)。在3個(gè)rhBMP-2緩釋體干預(yù)組囊腔組織內(nèi)，RANKL、OPG的表達(dá)及RANKL/OPG值均隨著rhBMP-2緩釋體濃度增高而遞減，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。

16、在空白組和200μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組的囊腔組織內(nèi)，RANKL、OPG的表達(dá)及RANKL/OPG值均未見(jiàn)明顯差異（均P＞0.05）。
　　 2.骨片行TRAP染色后，Imageproplus5.0軟件測(cè)量骨片破骨細(xì)胞染色面積比率的結(jié)果顯示:各組動(dòng)物模型囊腔內(nèi)骨片均可見(jiàn)TRAP染色的破骨細(xì)胞。鉻顆粒組囊腔內(nèi)的骨片破骨細(xì)胞染色面積比率明顯高于其他4組(均P＜0.05)。3個(gè)rhBMP-2緩釋體干預(yù)組囊腔內(nèi)骨片破骨細(xì)

17、胞染色面積比率隨著rhBMP-2緩釋體濃度增高而遞減，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。空白組和200μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組的囊腔內(nèi)骨片破骨細(xì)胞染色面積比率相互比較未見(jiàn)明顯差異(P=0.844，P＞0.05)。
　　 3.囊腔內(nèi)組織RANKL、OPG的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果提示:RANKLmRNA、OPGmRNA在各組動(dòng)物模型囊腔組織中均有表達(dá)。在鉻顆粒組囊腔組織中的RANKLmRNA、OPGmRNA表達(dá)

18、及RANKLmRNA/OPGmRNA值均明顯高于其他4組(均P＜0.05)。在3個(gè)rhBMP-2緩釋體干預(yù)組囊腔組織內(nèi)，RANKLmRNA、OPGmRNA的表達(dá)及RANKLmRNA/OPGmRNA值均隨著rhBMP-2緩釋體濃度增高而遞減，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。在空白組和200μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組的囊腔組織內(nèi)，RANKLmRNA、OPGmRNA的表達(dá)及RANKLmRNA/OPGmRNA值均未見(jiàn)明顯

19、差異（均P＞0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1.鉻顆?？梢砸鸫笫笾补菤饽夷Ｐ徒M織內(nèi)的RANKL/OPG值升高，促進(jìn)溶骨。大鼠植骨氣囊模型成功的模擬了人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)的生物學(xué)和組織學(xué)特征。
　　 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果中RANKL/OPG值與骨片破骨細(xì)胞染色面積比率存在的正相關(guān)性，又一次證明了RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)的RANKL/OPG值可反映骨代謝過(guò)程中的骨代謝情況。
　　 3.在一定濃度范圍內(nèi)，rh