攜載rhBMP-2微球的新型自凝固復(fù)合人工骨的制備及特性研究.pdf

1、骨缺損修復(fù)是當(dāng)前骨科領(lǐng)域研究的難題之一，傳統(tǒng)的自體或異體骨移植治療方法都存在各自難以克服的缺點(diǎn)，因此人們一直在進(jìn)行人工植骨材料的研究，開(kāi)發(fā)了一系列骨移植替代材料。在這些材料中磷酸鈣骨水泥(calciumphosphatecement，CPC)以其良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性引起人們的廣泛重視。CPC是由一種或幾種磷酸鹽的粉末加上稀酸或生理鹽水調(diào)和而成的一種新型自固化型人工骨替代材料，其固化后終產(chǎn)物為羥基磷灰石(HA)結(jié)晶。目前CPC因其良

2、好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性、可塑形性及聚合時(shí)不放熱等優(yōu)點(diǎn)而被應(yīng)用于臨床骨缺損修復(fù)，同時(shí)可作為生長(zhǎng)因子的載體。但臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)CPC存在以下問(wèn)題：1)CPC孔徑較小、孔隙率較低，不利于材料的降解和新骨的長(zhǎng)入。2)不具備骨誘導(dǎo)能力，即使其與骨誘導(dǎo)因子BMP復(fù)合后BMP的釋放速度緩慢，不利于充分發(fā)揮BMP誘導(dǎo)活性。 本研究首次將采用復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備的BMP/聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)載體微球與CPC復(fù)合，制備具有更高可降解性

3、及成骨活性的新型骨修復(fù)材料。其基本設(shè)計(jì)思路為：在材料植入早期PLGA微球不僅可作為BMP的載體微粒提高BMP的釋放，同時(shí)可維持材料一定的強(qiáng)度，隨著微球的降解可在CPC內(nèi)形成規(guī)則的空隙，從而提高CPC的孔徑及孔隙度，加快材料的降解和BMP的釋放。本文對(duì)這一復(fù)合材料進(jìn)行了系列研究，包括制備工藝、理化特性、生物學(xué)相容性和成骨活性等，并用于動(dòng)物骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)，為其進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。 1rhBMP-2/PLGA載藥微球的制備及成骨活

4、性研究采用復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備W/O/W型rhBMP-2/PLGA載藥微球，并在電鏡下觀察微球形態(tài)。為得到適合粒徑的微球，選擇影響微球粒徑的主要因素包括PLGA濃度、乳化劑PVA濃度、油水相之體積比(PLGA/PVA)進(jìn)行正交分組試驗(yàn)，以?xún)?yōu)化微球的制備工藝。采用ELISA法測(cè)定微球的載藥率及體外28天內(nèi)的釋藥速度，并將載藥微球植入鼠股部肌袋，通過(guò)X線、組織學(xué)檢查評(píng)價(jià)載體材料的異位成骨能力。結(jié)果顯示：采用優(yōu)化方案制備的載藥微球粒徑為253

5、±64μm，載藥率0.52％±0.14％，載藥微球rhBMP-2體外釋放呈雙相，24h釋藥率為15.2％±0.8％，隨后呈持續(xù)緩慢釋放，28天時(shí)達(dá)48.6％±5.3％。載藥微球植入鼠股部肌袋4W材料周?chē)忻黠@的骨形成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：通過(guò)復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備PLGA微球可以作為BMP的緩釋載體。 2rhBMP-2/PLGA微球/CPC復(fù)合人工骨制備及理化特性研究將攜載rhBMP-2的PLGA微球與rhBMP-2/磷酸鈣骨水泥(CP

6、C)分別以0∶100、50∶50、60∶40、70∶30體積比復(fù)合，制備出rhBMP-2/PLGA微球/CPC復(fù)合人工骨。用掃描電鏡(SEM)、萬(wàn)能生物力學(xué)測(cè)試儀、X線衍射分析(XRD)分析材料形貌、固化時(shí)間、組份變化、抗壓強(qiáng)度，同時(shí)測(cè)定不同時(shí)間材料體外降解液Ca、P離子濃度變化，以探討微球的摻入對(duì)CPC的固化過(guò)程和理化性能的影響，以及以怎樣的配比能使這些影響減至最小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨BMP/PLGA微球的摻入，復(fù)合材料的固化時(shí)間輕度增加，

7、抗壓強(qiáng)度由(29.48±6.42)MPa下降至(8.26±3.58)MPa，但復(fù)合材料的抗壓強(qiáng)度仍明顯高于PLGA微球降解后材料的強(qiáng)度。復(fù)合材料XRD圖中除出現(xiàn)PLGA的衍射峰外無(wú)其它峰出現(xiàn)。SEM檢測(cè)微球均勻鑲嵌于CPC中，微球完全降解時(shí)可在材料中形成相互連接的大的微孔。不同時(shí)間微球摻入復(fù)合材料組降解液的Ca、P離子濃度均高于對(duì)照。根據(jù)以上測(cè)定結(jié)果選取60∶40為PLGA/CPC最優(yōu)體積比進(jìn)行隨后試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：BMP/PLGA微

8、球的摻入對(duì)于材料的固化時(shí)間及力學(xué)強(qiáng)度產(chǎn)生輕度影響，可明顯提高材料的降解速度。 3rhBMP-2/PLGA微球/CPC復(fù)合人工骨生物相容性研究采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)方法制備空載PLGA微球，并將其與CPC復(fù)合制備PLGA微球/CPC復(fù)合人工骨。制備材料體外浸泡第1天、第7天的24h浸提液，將材料及其浸提液分別與人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外共培養(yǎng)，通過(guò)SEM觀察、MTT、ALP、OC測(cè)定，探討復(fù)合材料的細(xì)胞粘附能力及其浸提液對(duì)于人MS

9、Cs增殖和成骨分化的影響。SEM結(jié)果顯示：復(fù)合材料與MSCs細(xì)胞可良好粘附、增殖，細(xì)胞形態(tài)正常。與單純CPC材料相比較。體外培養(yǎng)時(shí)復(fù)合材料不同時(shí)間的浸提液對(duì)MSCs細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，對(duì)于細(xì)胞成骨分化的影響與單純CPC無(wú)明顯差別。證明rhBMP-2/PLGA微球/CPC新型復(fù)合人工骨具有良好的生物相容性。 4rhBMP-2/PLGA微球/CPC復(fù)合人工骨BMP體外釋放及活性研究將rhBMP-2/CPC、rhBMP-2/PLG

10、A微球/CPC試件置于PBS釋放介質(zhì)中，1d、3d、7d、14d、28d時(shí)取上清行rhBMP-2含量ELISA檢測(cè)。同時(shí)將第1天、第7天時(shí)材料24h的釋放液與MSCs體外共培養(yǎng)，通過(guò)MTT測(cè)定、ALP染色、細(xì)胞ALP、OC表達(dá)測(cè)定來(lái)分析材料釋放的BMP活性。釋藥測(cè)定結(jié)果顯示：復(fù)合材料24h的BMP體外釋放率為8.3％，隨后28天緩慢釋放，不同時(shí)間點(diǎn)的釋藥率均高于BMP/CPC組。不同材料BMP釋放液與MSCs體外共培養(yǎng)結(jié)果顯示：MSCs

11、的ALP、OC表達(dá)與BMP的釋放有劑量依存關(guān)系。從而表明復(fù)合材料可以作為BMP的載體，其具有良好的緩釋效果，釋放的BMP仍保持其骨誘導(dǎo)活性。 5rhBMP-2/PLGA微球/CPC復(fù)合人工骨的異位成骨活性研究將制備的rhBMP-2/CPC、rhBMP-2/PLGA微球/CPC塊分別植入小鼠兩側(cè)股部肌袋內(nèi)，術(shù)后2周、4周取材，進(jìn)行大體觀察、X線、組織學(xué)檢測(cè)，觀察成骨狀況和組織學(xué)反應(yīng)，以評(píng)價(jià)載體材料的組織相容性及異位成骨能力。X線檢

12、查示材料植入4周在復(fù)合材料周?chē)懈呙芏扔俺霈F(xiàn)，組織學(xué)觀察兩種植入物在植入初期周?chē)休p度非特異性炎癥反應(yīng)，材料周?chē)熊浌羌?xì)胞出現(xiàn)。4周后炎癥消失，材料周?chē)霈F(xiàn)有新骨，rhBMP-2/PLGA微球/CPC組成骨量明顯高于rhBMP-2/CPC對(duì)照組。表明復(fù)合材料具有較強(qiáng)的異位誘導(dǎo)成骨能力。 6rhBMP-2/PLGA微球/CPC復(fù)合人工骨修復(fù)兔骨缺損將制備出rhBMP-2/PLGA微球/CPC復(fù)合人工骨及rhBMP-2/CPC分別

13、植入兔雙側(cè)股骨髁骨缺損區(qū)域，術(shù)后4周、8周、12周取材，進(jìn)行大體觀察、X線、組織學(xué)及骨組織計(jì)量學(xué)檢測(cè)，觀察比較不同時(shí)期材料的降解及成骨情況，以評(píng)價(jià)材料修復(fù)骨缺損能力。X線檢查結(jié)果示：復(fù)合材料植入8周術(shù)后，材料密度明顯減低，邊緣模糊，12周植入材料已大部分吸收，而rhBMP-2/CPC組12周時(shí)未見(jiàn)材料的降解吸收征象。組織形態(tài)學(xué)觀察示：rhBMP-2/PLGA微球/CPC復(fù)合材料植入8周組材料已部分降解，微球降解所形成的孔洞內(nèi)有新生骨組織

14、，rhBMP-2/CPC組僅在材料周邊區(qū)域有少量降解及成骨。12周時(shí)，rhBMP-2/PLGA/CPC組材料大部分降解，骨缺損區(qū)新生骨的面積百分比為49％，而rhBMP-2/CPC組僅為18％。提示作為骨缺損的修復(fù)材料rhBMP-2/PLGA微球/CPC復(fù)合人工骨具有良好的降解性和成骨活性。 以上試驗(yàn)結(jié)果表明：采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備的rhBMP-2/PLGA微球的摻入可提高CPC材料的降解速度和BMP的釋放，從而提高材料的降解性