復(fù)合膠原-rhBMP-2殼聚糖微球的3D打印多孔羥基磷灰石支架的制備及其異位成骨研究.pdf

1、第一部分、香草醛交聯(lián)rhBMP-2/殼聚糖微球的制備及其對間充質(zhì)干細(xì)胞的影響研究
　　背景:RhBMP-2是一種重要的骨誘導(dǎo)活性蛋白，它在體內(nèi)具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)骨組織生成的能力。而既往的研究表明rhBMP-2在體內(nèi)的釋放模式對其誘導(dǎo)成骨的作用具有重要的影響， rhBMP-2早期的突釋結(jié)合后期的持續(xù)釋放較短時間大劑量釋放能夠更高效的誘導(dǎo)骨組織生成。殼聚糖是一種來源廣泛的天然生物材料，具有良好的生物相容性，它可作為許多細(xì)胞因子的緩釋載體。

2、同時香草醛與傳統(tǒng)的交聯(lián)劑（戊二醛等）相比生物相容性更好。因此用香草醛為交聯(lián)劑有可能制備出生物相容性更好，且具有良好緩釋性能的rhBMP-2/殼聚糖微球。
　　目的:以香草醛為交聯(lián)劑來制備rhBMP-2/殼聚糖微球，明確該微球在體外rhBMP-2的緩釋性能，并且明確微球緩釋的rhBMP-2對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響。
　　方法:利用乳化交聯(lián)法來制備包載rhBMP-2的殼聚糖微球，用電鏡觀察微球的形態(tài)。以微球浸提液為實驗組，以空白

3、培養(yǎng)基為對照組來培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞，以檢測微球的細(xì)胞毒性和對細(xì)胞增殖的影響。用動態(tài)浸泡的方法來檢測rhBMP-2的體外釋放特征。通過比較緩釋3天和7天獲取的微球緩釋液與空白培養(yǎng)基對細(xì)胞ALP表達(dá)的影響，來反應(yīng)緩釋的rhBMP-2是否具有生物活性。
　　結(jié)果:所制備的殼聚糖微球呈球狀。將微球浸提液與人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)24及48小時，兩個時間點實驗組與對照組OD值無顯著性差異(24h:0.719±0.072比0.726±0.051,p

4、＞0.05;48h:1.192±0.108比1.273±0.058,p＞0.05)。將浸提液與細(xì)胞培養(yǎng)1、3和7天，實驗組和對照組細(xì)胞數(shù)量均逐漸增多，且每個時間點實驗組與對照組OD值無明顯差異。5mg微球在體外釋放19天，rhBMP-2逐漸釋放，第19天檢測濃度仍達(dá)到216.14±20.00ng/mL。緩釋3天與7天組間充質(zhì)干細(xì)胞ALP活性分別為:(0.504±0.065)、(0.684±0.060)μmolpNPP/min/mg pr

5、otein，均顯著高于空白培養(yǎng)基組(0.135±0.011)（p＜0.05）。
　　結(jié)論:用香草醛為交聯(lián)劑制備的rhBMP-2微球具有良好的生物相容性，能夠達(dá)到緩釋rhBMP-2的目的，且在制備過程中仍能保持rhBMP-2的生物活性。
　　第二部分、膠原/rhBMP-2殼聚糖微球修飾的多孔HA支架的制備及體外生物相容性研究
　　背景:隨著快速成形技術(shù)的發(fā)展，目前許多材料可通過三維打印技術(shù)制備出個性化的骨修復(fù)材料，由于它

6、是增材制造技術(shù)，因此能夠?qū)崿F(xiàn)對材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)的精細(xì)控制。目前通過該技術(shù)可制備出內(nèi)部孔隙高度貫通的骨修復(fù)支架，然而單純依靠結(jié)構(gòu)的改變很難實現(xiàn)大塊骨修復(fù)材料內(nèi)部骨組織的充分長入。因此良好的骨組織工程支架還需要具備一定的骨誘導(dǎo)活性。將骨誘導(dǎo)活性蛋白與多孔骨組織工程支架相結(jié)合，從而構(gòu)建出同時具備骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性的支架材料有可能成為大塊骨缺損修復(fù)的良好選擇。
　　目的:通過三維打印技術(shù)制備多孔HA支架，并對支架進(jìn)行膠原/rhBMP-2殼聚糖

7、微球涂層修飾，從而構(gòu)建出同時具備骨誘導(dǎo)活性和骨傳導(dǎo)性的復(fù)合多孔HA支架，并且在體外驗證復(fù)合支架的生物相容性。
　　方法:用計算機(jī)建立多孔支架的三維模型，然后用擠壓成形系統(tǒng)制備多孔HA支架，并進(jìn)行微波熱處理。分別對支架進(jìn)行膠原涂層(HC)和膠原/rhBMP-2殼聚糖微球涂層(HCC)構(gòu)建復(fù)合支架。用環(huán)境掃描電鏡分別觀察HA、HC及HCC支架的表面形貌。用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來檢測所合成支架的細(xì)胞毒性以及對細(xì)胞增殖的影響。將人骨髓間充質(zhì)

8、干細(xì)胞滴加到支架的表面，觀察不同復(fù)合支架表面粘附細(xì)胞的差異。通過動態(tài)浸泡的方法來檢測HCC支架中rhBMP-2體外釋放的方式。將支架分別浸泡1、3和7天后，收集浸提液，檢測浸提液中rhBMP-2對細(xì)胞ALP活性的影響，從而間接的反應(yīng)復(fù)合材料中rhBMP-2的活性。
　　結(jié)果:通過電鏡觀察結(jié)果顯示3D打印的HA支架表面可形成膠原涂層，并且將rhBMP-2殼聚糖微球滴加到支架后，在支架的表面可見有微球的粘附，且部分微球發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象。支

9、架浸提液細(xì)胞毒性實驗結(jié)果顯示所合成的支架在24小時和48小時兩個時間點，HCC組浸提液細(xì)胞活性與HC、HA及空白組相比無明顯差異。將細(xì)胞與支架混合培養(yǎng)1、3和7天結(jié)果顯示各個時間點每組間細(xì)胞數(shù)量都逐漸增加，且在每個時間點各個組間細(xì)胞數(shù)量無明顯差異。細(xì)胞粘附實驗結(jié)果顯示hMSCs可粘附于多孔支架表面，且HCC支架表面粘附的細(xì)胞數(shù)較其他組多。體外釋放實驗結(jié)果顯示，HCC支架表面rhBMP-2的釋放可持續(xù)3周以上，且每個時間點測得的rhBMP

10、-2濃度都高于112.8ng/ml。ALP活性檢測結(jié)果顯示所釋放的rhBMP-2仍可誘導(dǎo)hMSCs細(xì)胞ALP活性增加。
　　結(jié)論:膠原/rhBMP-2殼聚糖微球涂層是將rhBMP-2與三維打印HA支架進(jìn)行復(fù)合的良好方法，所構(gòu)建的復(fù)合支架具有良好的生物相容性且能夠長時間的緩釋有活性的rhBMP-2。它在體外可以良好的支持人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和粘附。
　　第三部分、膠原/rhBMP-2殼聚糖修飾的多孔HA支架的體內(nèi)誘導(dǎo)異位成

11、骨研究
　　背景:骨修復(fù)材料與宿主骨的緊密結(jié)合是防止內(nèi)植物松動，移位或者疲勞性斷裂的重要保證。單純的多孔材料可通過調(diào)節(jié)材料的孔隙率或者表面改性增加細(xì)胞粘附等方式提高材料的骨傳導(dǎo)性。然而對于大塊骨修復(fù)材料，單純依靠增加骨傳導(dǎo)性來達(dá)到骨組織向材料內(nèi)部生長的方法作用有限。如何讓復(fù)合材料具備誘導(dǎo)組織細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，而實現(xiàn)自身誘導(dǎo)成骨的能力，是大塊骨修復(fù)材料的研究熱點。
　　目的:比較單純的HA支架、經(jīng)膠原涂層的HC支架以及膠原/

12、rhBMP-2殼聚糖微球修飾的多孔HCC支架在兔肌袋內(nèi)的埋植后支架內(nèi)部組織生長的差異。明確經(jīng)rhBMP-2殼糖微球修飾的支架內(nèi)部骨組織分布的情況。
　　方法:用新西蘭大白兔股四頭肌肌袋作為異位成骨的模型。實驗分3組:HA、HC及HCC組。于每只兔子右后肢作長1cm切口，并制備股四頭肌肌袋模型，分別將支架埋入肌袋內(nèi)，每組8只，于4周和8周時取出標(biāo)本，用硬組織切片機(jī)制備組織切片，并用VG染色后觀察組織生長情況。用micro-CT對標(biāo)本

13、進(jìn)行掃描分析，明確骨組織生長情況。用mimics軟件進(jìn)行骨組織三維重建，觀察所形成的骨組織大體觀。
　　結(jié)果:植入8周時組織樣本的大體觀可見，HCC支架表面的軟組織較為致密且與材料粘附緊密，而HA及HC組周圍的軟組織較為疏松容易從支架上脫落。HCC支架micro-CT觀察結(jié)果顯示4周時骨體積分?jǐn)?shù)為11.56％，而到了8周時則為17.14％。隨著植入時間的延長，骨小梁的厚度(4周:0.074±0.05mm;8周:0.083±0.05

14、mm)和骨量(4周:4.69±1.09mm3;8周:7.12±1.56mm3)都逐漸的增大。標(biāo)本的硬組織切片觀察結(jié)果顯示HA及HC組支架內(nèi)部主要由纖維組織和脂肪組織充填而無新生的骨組織，而HCC組支架的表面可見有新生的骨組織生成，且骨組織由內(nèi)向外較均勻的粘附于支架的孔壁上，且4周較8周時骨小梁的厚度增加。三種支架孔隙內(nèi)均可見到有新生的血管組織生成。
　　結(jié)論:本研究所制備的膠原/rhBMP-2殼聚糖微球涂層支架可有效的在體內(nèi)誘導(dǎo)骨