DSs-rh-BMP-2-CS復合微球的制備及成骨活性研究.pdf

1、骨缺損是長期困擾骨科臨床有效治療的難題，骨腫瘤、嚴重的骨創(chuàng)傷均可能引起骨缺損，因此各種骨修復材料相繼推出，主要包括自體骨、異體骨和人工骨等類型。自體骨吸收快，效果好，但是受來源問題的限制;異體骨、異種骨則因免疫排斥反應在臨床應用受到限制，而且其存在傳染疾病的風險。人工骨憑借具備取材廣泛、易加工、生物相容性好、價格低廉、能消毒、利于臨床操作等優(yōu)點，成為目前人工骨修復材料的主流。人工骨修復材料主要包括無機材料和有機材料兩類，前者以羥基磷灰石

2、(hydroxylapatite，HA)和磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)為代表，后者則以聚乳酸、聚乙醇酸或兩者的共聚物為代表。無機材料相對于有機材料，機械強度好，其中珊瑚羥基磷灰石(Coralline Hydroxyapatite，CHA)更是因來源廣泛、生物相容性好、骨傳導作用好、對人體無害等特點而受到臨床應用的青睞。盡管人工骨已經(jīng)應用于臨床并取得了較好的效果，但是植入體內(nèi)的人工骨往往不能滿足臨床需要，導

3、致植骨失敗。這是因為人工骨(直徑＞5 mm)植入人體后，人工骨中心部位營養(yǎng)物質(zhì)供應不足，氧分壓低，不能滿足人工骨中心部位的種子細胞生長、增殖、分化和成骨的需要，導致種子細胞停止生長甚至死亡，使成骨效應喪失，其根本原因在于組織工程骨骨誘導效應不強;另外，人工骨的成骨效應欠佳也是制約人工骨發(fā)展的一個重要原因。為此，國內(nèi)外研究了三種方法解決人工骨的骨化活性:一種是采用聯(lián)合細胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)的細胞與人工骨復合，將不同類型的細胞進行混合培養(yǎng)，通過細

4、胞間存在著精細的相互調(diào)控關系來促進細胞的生長分化。常用來培養(yǎng)的細胞有成纖維細胞，平滑肌細胞和成骨細胞。聯(lián)合細胞培養(yǎng)的優(yōu)點是活細胞能促進成骨效應，但操作繁瑣，培養(yǎng)周期長，臨床不易于推廣;另外一種方法就是采用顯微外科手術來促進人工骨的骨誘導效應，目前主要有預購帶血管蒂筋膜瓣包裹人工骨、帶血管蒂肌瓣包裹人工骨。預購復合組織瓣具有血供可靠，人工骨存活能力強，抗感染能力強等優(yōu)點，但缺點也很明顯，就是先需行預購手術，增加了病人的痛苦;還有一種方法就

5、是采用細胞生長因子來促進人工骨骨誘導效應，方法簡便，臨床易于推廣。相對來說，采用細胞生長因子促進人工骨骨化活性具有顯著地臨床應用優(yōu)勢，已經(jīng)成為該領域研究的熱點，近期關于細胞生長因子促進人工骨骨誘導效應的文章發(fā)表在國際相關研究領域的頂尖雜志上。目前用于促進人工骨骨化生長因子有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMPs），血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth fac

6、tor，VEGF)，轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等。而對于骨誘導效應的研究，主要集中在BMPs上，目前研究表明BMPs具有明顯的成骨效應。但是因半衰期短，容易代謝流失，不能維持足夠的濃度。目前，通過緩釋載體負載活性生長因子可有效地解決這一問題。近年來，對負載活性生長因子緩釋載體的研究正受到越來越廣泛的重視和關注，從傳統(tǒng)載體到各種載藥微球載體，目標是延長生長因子的緩釋時間，精確控

7、制釋放濃度，拓展其適用范圍。但是，對于怎樣利用緩釋微球來調(diào)控活性細胞因子按照臨床要求進行釋放，以最大限度的促進人工骨成骨誘導活性，是需要解決的主要問題。近年來微球控釋技術的發(fā)展和人工可降解材料及其復合材料的不斷涌現(xiàn)，為活性細胞因子的可控緩釋和組織工程化人工骨成骨誘導活性的提高提供了前所未有的機遇和條件。將微球控釋系統(tǒng)應用于活性生長因子的緩釋，為外源性生長因子的開發(fā)與利用開辟了新的研究空間。針對人工骨成骨誘導活性緩釋微球的研究，國內(nèi)外很多

8、學者利用高分子合成與結構控制技術制備了骨形態(tài)發(fā)生蛋白緩釋微球，取得良好的成骨效應，但是在微球結構控制、微球分子和生長因子之間的相互作用對生長因子釋放過程的影響以及如何通過微球結構實現(xiàn)對生長因子釋放過程的調(diào)控尚需要深入研究。特別是為了提高載生長因子復合微球促進成骨誘導活性，必須深入研究負載生長因子的聚合物微球促進骨化活性的影響因素，這些包括:微球種類、微球結構、生長因子種類以及微球和生長因子之間的相互作用機制、生長因子的釋放過程控制等。<

9、br>　　 本項目構建了一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的聚合物復合微球，取得了良好的骨誘導效應。由于性能優(yōu)異的聚合物微球載體，是讓細胞生長因子按照臨床需要控釋的關鍵。本項目選用殼聚糖(CS)為合成載體微球的模型聚合物，殼聚糖是天然多糖中唯一的堿性多糖，其分子2位上有游離氨基，通過醛氨縮合反應使之形成鍵橋固化微球，可將藥物固定在其骨架中，其微球具有無毒、生物相容性好、生物可降解、控制藥物釋放、增加藥物局部滯留、提高藥物的生物利用度等特點。但是

10、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖復合微球載藥率較低（33.437±2.290μg/mg），究其原因，主要是重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白與殼聚糖之間的作用主要是靜電作用，在微球的制備過程中，無法大量的結合。因此我們引入硫酸葡聚糖(DS)作為中間載體，硫酸葡聚糖與骨形態(tài)發(fā)生蛋白有肝素結合位點，能廣泛結合，制備的硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖微球具有更好的載藥率和穩(wěn)定釋放效應。目前，有關負載活性生長因子緩釋載體的研究中，臨床使用性能研究

11、較多，而有關生長因子和載體之間相互作用機制研究較少，而這是決定活性生長因子緩釋過程的主要因素。同時緩釋體在促進成骨活性過程中的影響因素也需要系統(tǒng)研究。有鑒于此，本項目采用殼聚糖和硫酸葡聚糖制備單一和復合微球，利用共振光散射光譜和熒光光譜法研究生長因子（重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2）和微球載體聚合物（殼聚糖、硫酸葡聚糖）之間的相互作用機理及其對重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2釋放過程的影響，闡明重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2釋放過程中的熱力學和動力學控制過

12、程及復合微球緩釋機制;研究微球粒子形態(tài)結構、粒子尺寸及分布控制方法以及他們對包裹藥物的負載率及釋放過程的影響，揭示載藥載體的功能化形態(tài)結構對重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2釋放過程的調(diào)控;并通過細胞實驗和動物實驗，研究硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖復合微球釋放過程及其骨誘導效應。本項目的研究成果對骨缺損的人工修復提供新思路和理論指導。
　　 目的：⑴制備殼聚糖/硫酸葡聚糖納米微球，對硫酸葡聚糖/殼聚糖納米微球的聚電解質(zhì)復合

13、過程進行研究，探討了pH值、離子濃度等因素對殼聚糖、硫酸葡聚糖之間的相互作用的影響，分析載蛋白空白微球的徑粒范圍，為制備硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖微球提供理論依據(jù)。⑵制備硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球，觀察微球的形態(tài)，并對微球的徑粒、分散度進行研究，計算蛋白包封率、載藥率，繪制緩釋曲線。⑶對硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球的聚電解質(zhì)復合過程進行研究，探討了pH值、離子濃度等因素

14、對重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、殼聚糖、硫酸葡聚糖之間的相互作用的影響，結合緩釋曲線，分析緩釋機制。⑷評估硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球的生物安全性，為硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球的臨床應用及骨誘導活性研究提供理論依據(jù)。⑸設計細胞學實驗，評估硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球體外對骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨誘導活性，并與空白微球組、游離重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2組組進行對比，從細胞學

15、的角度評估兩種微球成骨效應的異同。⑹統(tǒng)計學處理:計量資料的統(tǒng)計描述用均數(shù)±標準差表示，運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較用單因素方差分析，方差齊時組間多重比較用LSD-t檢驗法，若方差不齊則應用Games-Howell法。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 方法：①應用離子交聯(lián)法制備殼聚糖/硫酸葡聚糖納米微球，采用共振光散射法研究pH值、離子濃度等因素對硫酸葡聚糖、殼聚糖之間的相互作用的影響，應用掃描電鏡和Ze

16、ta電位分析載蛋白空白微球的徑粒范圍，為復和硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖微球提供理論依據(jù)。②應用離子交聯(lián)法制備硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球，采用掃描電鏡和原子力顯微鏡觀察微球的形態(tài)，并對微球的徑粒、分散度進行研究，應用重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2試劑盒計算蛋白包封率、載藥率，繪制緩釋曲線。③采用共振光散射法對硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球的聚電解質(zhì)復合過程進行研究，應用共振光散射

17、法探討pH值、離子濃度等因素對重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、殼聚糖、硫酸葡聚糖之間的相互作用的影響，結合緩釋曲線，分析緩釋機制。④按照國家標準植入材料的生物安全評估實驗對硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球的生物毒性進行評估，復蘇并傳代培養(yǎng)鼠成纖維細胞，進行硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球和硫酸葡聚糖/殼聚糖空白微球的細胞毒性實驗，設置對照組，對其生物安全性進行評估。⑤設計細胞學實驗，體外傳代培養(yǎng)SD大鼠

18、的骨髓間充質(zhì)干細胞，加入硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球、硫酸葡聚糖/殼聚糖空白微球、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，通過MTT檢測法研究硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球體外對骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨誘導活性，并與空白微球組、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2組、陰性對照組進行對比分析。
　　 結果：⑴應用離子交聯(lián)法制備硫酸葡聚糖納/殼聚糖納米微球，掃描電鏡和原子力顯微鏡下提示微球成球良好，形態(tài)規(guī)整，分散度

19、好，平均徑粒為210nm，硫酸葡聚糖/殼聚糖納米微球復合溶液的RLS強度在外界條件刺激如改變?nèi)芤簆H和添加金屬離子時會發(fā)生急劇的變化。在常溫狀態(tài)下，硫酸葡聚糖納和殼聚糖可結合為聚電解質(zhì)復合物。⑵應用離子交聯(lián)法成功制備硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖微球，CS/DS/rh-BMP-2納米微球分布均勻，平均粒徑為(217±8)nm，微球包封率和載藥量分別為（85.6±3）％和（47.245±3.321）ug/mg。微球體外釋放在

20、2小時后出現(xiàn)一個突釋放期，2天后釋放度達高峰，之后緩慢下降，釋放周期約28天。⑶應用共振光散射的方法研究CS、DSS、與rhBMP-2之間的關系，結果表明，CS與rhBMP-2之間的相互作用弱，主要作用力為范德華力， DSS與rhBMP-2之間存在肝素結合位點，有較強的相互作用。在制備的過程中，rhBMP-2與DSS優(yōu)先結合，而在緩釋過程中，與CS結合的rhBMP-2會優(yōu)先釋放。⑷按照國家標準植入材料的生物安全評估實驗對硫酸葡聚糖/重組

21、人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球的生物毒性進行評估，復蘇并傳代培養(yǎng)鼠成纖維細胞，細胞毒性試驗提示硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖生物相容性好，無明顯細胞毒性。殼聚糖/硫酸葡聚糖納空白微球載體的生物相容性可靠，無細胞毒性，是良好的蛋白載體。⑸體外傳代培養(yǎng)SD大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞，加入硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球、殼聚糖/硫酸葡聚糖納空白微球、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)硫酸葡聚糖/重組人

22、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球體和游離重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白在實驗濃度下對骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖效應促進不明顯。對骨髓間充質(zhì)干細胞的分化效應有明顯的促進作用，培養(yǎng)3d內(nèi)，硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球提高骨髓間充質(zhì)干細胞ALP含量的作用低于游離重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，但5d后，硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖納米微球有效控制重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的釋放，使得硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼

23、聚糖納米微球促進骨髓間充質(zhì)干細胞的分化的效應明顯強于游離重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2組，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。光學顯微鏡下觀察鈣結節(jié)的生長情況發(fā)現(xiàn)7d后，硫酸葡聚糖/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖組的鈣結節(jié)生長情況明顯好于游離重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2組，促進骨髓間充質(zhì)干細胞分化作用明顯。
　　 結論：應用離子交聯(lián)法制備硫酸葡聚糖納/殼聚糖納米微球，微球成球良好，形態(tài)規(guī)整，分散度好，并表現(xiàn)出了良好的緩釋性能。利用共振光散射光

24、譜和熒光光譜法研究生長因子（重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2）和微球載體聚合物（殼聚糖、硫酸葡聚糖）之間的相互作用機理及其對重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2釋放過程的影響，闡明重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2釋放過程中的熱力學和動力學控制過程及復合微球緩釋機制;研究微球粒子形態(tài)結構、粒子尺寸及分布控制方法以及他們對包裹藥物的負載率及釋放過程的影響，揭示載藥載體的功能化形態(tài)結構對重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2釋放過程的調(diào)控;并通過體外細胞毒性實驗和細胞增殖分化實驗證實