BMP-2-膠原-摻鍶羥基磷灰石成骨活性材料的研究.pdf

1、第一部分骨形態(tài)蛋白-2 對(duì)人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的影響
　　 目的:探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bmp-2）對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCMSC）的增殖和分化的影響。
　　 方法:體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面CD34、CD45、CD105、CD45、CD73和HLA-DR分子的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分為6組，分別是10％血清DMEM、10％血清DMEM+成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、10％血清DMEM+BMP-2(20ug/

2、ml)、2％血清DMEM、2％血清DMEM+成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、2％血清DMEM+BMP-2(20ug/ml)，噻唑藍(lán)(MTT)比色法觀察不同培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMP-2 作用后細(xì)胞表面STRO-1表達(dá)的變化，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)量BMP-2 作用后人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的骨橋蛋白（OPN）、堿性磷酸酶（ALP）、I 型膠原蛋白(COL1)的mRNA表達(dá)變化，堿性磷酸酶染色觀察人臍帶間充質(zhì)

3、干細(xì)胞在BMP-2 培養(yǎng)基作用下細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的比例變化，Von kossa 染色試驗(yàn)觀察BMP-2 對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成的情況。
　　 結(jié)果:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定為CD34(-)、CD45(-)、CD44(+)、CD73(+)、CD105(+)、HLA-DR(-)細(xì)胞。對(duì)比無(wú)BMP-2和加BMP-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞1，3，5，7天，雖然細(xì)胞的增殖率在上升，但是在組間比較，無(wú)明顯意義，同時(shí)在

4、2％血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后，hUCMSC的增殖促進(jìn)才10％左右。BMP-2 培養(yǎng)7天后細(xì)胞表面STRO-1 陽(yáng)性細(xì)胞比例上升明顯，由25.1±4.0 上升至51.1±6.4。BMP-2 培養(yǎng)條件下，COL1mRNA的表達(dá)可以見(jiàn)到增強(qiáng)，OPNmRNA出現(xiàn)表達(dá)，ALPmRNA 比無(wú)BMP-2 培養(yǎng)出現(xiàn)明顯增強(qiáng)。在BMP-2 培養(yǎng)條件下，堿性磷酸酶染色出現(xiàn)大片陽(yáng)性染色。在培養(yǎng)28天，Von kossa 染色出現(xiàn)明顯的鈣結(jié)節(jié)。
　　

5、結(jié)論：骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化作用明顯，而增殖作用很弱。
　　 第二部分鍶對(duì)人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化影響的研究
　　 目的：探討氯化鍶誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCMSC）成骨分化過(guò)程中β-連接蛋白（β-Catenin）的作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為3組，空白組：10％胎牛血清+DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組：10％胎牛血清+DMEM 培養(yǎng)基+成骨培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組：1

6、0％胎牛血清+DMEM培養(yǎng)基+氯化鍶，檢測(cè)3組不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的堿性磷酸酶活性變化。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)量人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的骨橋蛋白（OPN）、β-Catenin、I 型膠原蛋白(COL1)的mRNA表達(dá)變化，蛋白印跡法檢測(cè)β-Catenin 蛋白表達(dá)的變化。熒光染色觀察在加入氯化鍶的培養(yǎng)基中β-Catenin的表達(dá)。Von kossa 染色試驗(yàn)觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成的情況。
　　

7、結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在第5天，堿性磷酸酶活性由39.871±8.166 U/g.prot 增加到70.317±14.231U/g.prot，在第14天，實(shí)驗(yàn)組的堿性磷酸酶的活性可以高達(dá)138.617±40.207 U/g.prot，與空白組和對(duì)照組相比都有明顯增加。在實(shí)驗(yàn)組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的堿性磷酸酶（ALP）mRNA 出現(xiàn)高表達(dá)。空白組的骨橋蛋白（OPN）表達(dá)很弱，而對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的OPN 出現(xiàn)明顯的表達(dá)。對(duì)比空白組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組I

8、型膠原蛋白（COL1）的表達(dá)可以見(jiàn)到明顯增強(qiáng)?？瞻捉M的β-Catenin 蛋白表達(dá)很弱，而對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的β-Catenin 蛋白出現(xiàn)明顯的表達(dá)。細(xì)胞熒光觀察到在還有氯化鍶培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中出現(xiàn)細(xì)胞漿內(nèi)紅色熒光，部分細(xì)胞核也有紅色熒光。含有氯化鍶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)28天后，可以看到hUCMSC 形成大量的鈣結(jié)節(jié)。
　　 結(jié)論：β-Catenin是氯化鍶誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化中重要通路蛋白。
　　 第三部分骨

9、形態(tài)蛋白-2 聯(lián)合氯化鍶對(duì)人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化實(shí)驗(yàn)
　　 目的：探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bmp-2）聯(lián)合氯化鍶對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCMSC）
　　 的增值和分化的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為3組，空白組：10％胎牛血清+DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組：10％胎牛血清+DMEM 培養(yǎng)基+成骨培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組：10％胎牛血清+DMEM培養(yǎng)基+BMP-2+氯化鍶，噻唑藍(lán)(MTT)比色法觀察人

10、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增值效果，并檢測(cè)3組不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的堿性磷酸酶活性變化，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)量不同組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的骨橋蛋白（OPN）、堿性磷酸酶（ALP）、I 型膠原蛋白(type 1collagen,COL1)的mRNA表達(dá)，蛋白印跡法檢測(cè)smad和p38 蛋表達(dá)的變化。von kossa染色試驗(yàn)觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成的情況。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖率在

11、第5天和第7天是明顯高于空白組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在第5天，堿性磷酸酶活性就由33.443±9.061U/g.prot 增加到80.209±17.011 U/g.prot，在第14天，實(shí)驗(yàn)組的堿性磷酸酶的活性可以高達(dá)145.705±45.871 U/g.prot，對(duì)比空白組和對(duì)照組都有明顯增加。在實(shí)驗(yàn)組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的堿性磷酸酶（ALP）mRNA 出現(xiàn)高表達(dá)?？瞻捉M的骨橋蛋白（OPN）表達(dá)很弱，而對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的OPN 出現(xiàn)明顯的表

12、達(dá)。對(duì)比空白組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組I 型膠原蛋白（COL1）的表達(dá)可以見(jiàn)到明顯增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)組中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的Smad1/5/8 蛋白出現(xiàn)高表達(dá)?？瞻捉M的P38 蛋白表達(dá)很弱，而對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的P38 蛋白出現(xiàn)明顯的表達(dá)，含有BMP-2和氯化鍶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)28天后，可以看到hUCMSC 形成大量的鈣結(jié)節(jié)。
　　 結(jié)論：聯(lián)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和氯化鍶對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞增殖和成骨誘導(dǎo)分化都有促進(jìn)作用。
　　 第四部分

13、BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石材料制備和顱骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)
　　 目的：制備BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石材料并探討其修復(fù)大鼠顱骨缺損的可行性和有效性。
　　 方法：用1 型膠原制備單純膠原、膠原/羥基磷灰石、膠原/摻鍶羥基磷灰石、BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石4組骨修復(fù)材料，并進(jìn)行掃描電鏡觀察4 種材料表面的結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組，每組12只大鼠，在大鼠頭顱制備顱骨極限骨缺損模型，并將上述骨修復(fù)材料分別植入骨缺損處

14、。術(shù)后12周取大鼠顱骨，CT 掃描觀察骨缺損修復(fù)影像學(xué)。HE和Masson 染色觀察骨缺損組織學(xué)，并在骨缺損及其周?chē)律遣课恍泄菢虻鞍祝∣PN）和β-catenin 免疫組織化學(xué)染色。
　　 結(jié)果：在掃描電鏡下檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)單純的膠原材料為交織樣物質(zhì)結(jié)構(gòu)，膠原/羥基磷灰石材料為交織晶體板狀結(jié)構(gòu)。膠原/摻鍶羥基磷灰石和BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石材料晶體結(jié)構(gòu)為單晶體交織狀。12周后，骨缺損顱骨CT 掃描發(fā)現(xiàn)單純膠原組的顱骨缺

15、損可見(jiàn)輕微的云霧狀高密度影，三維重建可見(jiàn)明顯的骨質(zhì)缺損，骨缺損部位平均CT 值為98.5±10.2 hu。而膠原/羥基磷灰石材料、膠原/摻鍶羥基磷灰石、BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石材料在12周顱骨缺損部位都有片狀高密度影，但是骨缺損部位的CT 值有明顯的差異，BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石材料缺損部位CT 值最高。HE和Masson 染色見(jiàn)BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石組，骨質(zhì)愈合完全，原骨缺損處多為紅色成熟骨。膠原/摻鍶羥基磷

16、灰石組植入?yún)^(qū)內(nèi)藍(lán)色的新生骨較多，材料邊緣與骨組織結(jié)合緊密牢固，骨痂橋接完全，內(nèi)含成熟骨。膠原/羥基磷灰石材料組植入?yún)^(qū)，在植入材料邊緣新生骨形成，界限仍然清晰。單純膠原組骨質(zhì)未愈合，骨缺損處為大量膠原組織，淡藍(lán)色條索狀結(jié)構(gòu)，中間未見(jiàn)軟骨及成熟骨形成。BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石組存在大量棕色的骨橋蛋白和β-catenin 染色陽(yáng)性新生骨組織，而膠原/摻鍶羥基磷灰石組和膠原/羥基磷灰石組的骨橋蛋白和β-catenin 陽(yáng)性新生骨組織依次