rhBMP-2結(jié)合膠原膜在兔顱骨引導(dǎo)骨再生模型中的成骨效應(yīng)研究.pdf

1、研究背景：
　　 近年來，隨著口腔種植外科技術(shù)提高和生物材料的發(fā)展，口腔種植學(xué)迅猛發(fā)展。然而，骨量不足仍然是種植義齒面臨的一個主要問題，大量的牙種植病員都需行骨增量手術(shù)解決此問題。但骨增量的成功與否很大程度上依賴于骨代用品材料的引導(dǎo)骨再生的效能。因此，人們努力通過科學(xué)研究提高骨代用品的骨引導(dǎo)及骨誘導(dǎo)能力促進(jìn)骨生成作用。
　　 在種植臨床實(shí)踐中，骨量不足特別是牙槽骨高度及寬度不足常導(dǎo)致種植體植入困難甚至無法植入，臨床醫(yī)生常

2、用引導(dǎo)骨再生術(shù)實(shí)現(xiàn)牙槽嵴的骨增量。引導(dǎo)骨再生術(shù)是指用屏障膜維持手術(shù)建立的空間，阻擋增值快速的纖維組織的長入，以保證增值速度較慢的成骨細(xì)胞和血管從牙槽嵴順著骨粉往上生長。臨床上所用屏障膜主要是膠原膜，它起機(jī)械性阻擋和隔離的作用，不具備主動誘導(dǎo)作用，當(dāng)臨床上牙槽嵴缺損較多時，只從牙槽嵴項(xiàng)往上成骨使骨增量效果欠佳。
　　 目的：
　　 鑒于以上的問題，本研究將具有與膠原靶向結(jié)合能力的rhBMP-2復(fù)合到膠原膜上，形成有骨誘導(dǎo)件

3、的膠原膜，研究其在兔顱骨引導(dǎo)骨再生動物模型中的成骨效應(yīng)，為有效使用生長因子提高成骨效應(yīng)提供理論依據(jù)及實(shí)踐參考。
　　 方法：
　　 1.用純鈦棒機(jī)械加工成一定規(guī)格的鈦筒，充分拋光后進(jìn)行多次超聲及化學(xué)試劑表面清洗，分裝、高溫高壓消毒、干燥備用。
　　 2.實(shí)驗(yàn)動物及分組：
　　 選用5～6月齡，體重為2.7-3.2kg，普通級雌性健康新西蘭大白兔45只。
　　 實(shí)驗(yàn)動物分組：
　　 每只兔顱

4、頂骨可植入四個鈦筒，本實(shí)驗(yàn)四個處理組，分布在同一個動物身上。四個鈦筒均裝骨粉到肩臺水平，A組：蓋rhBMP2-h/膠原膜；B組：蓋游離rhBMP-2/膠原膜；C組蓋膠原膜；D組不蓋膜。
　　 用45只新西蘭大白兔進(jìn)行造模實(shí)驗(yàn)，其中5只兔出現(xiàn)鈦筒松動，不納入統(tǒng)計分析。剩余40只兔完全隨機(jī)分成1、2、3、4四個組，每組10只。第1組實(shí)驗(yàn)時間2周，第2組實(shí)驗(yàn)時間4周，第3組實(shí)驗(yàn)時間6周，第4組實(shí)驗(yàn)時間12周。
　　 每個時間段

5、每個處理組有10個樣本量。
　　 其中8個樣本進(jìn)行塑料包埋亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色后做骨組織學(xué)觀察和計量學(xué)分析，2個樣本進(jìn)行石蠟包埋HE染色行組織學(xué)觀察。
　　 3.手術(shù)過程及動物模型建立：
　　 手術(shù)方法：每只兔的顱骨上制備四個環(huán)形骨裂隙，通過鈦筒自身的螺紋旋轉(zhuǎn)攻入骨內(nèi)從而將鈦筒固定，植入骨粉，四個鈦筒頂端分別給予蓋rhBMP2-h/膠原膜、游離rhBMP-2/膠原膜、膠原膜或者不蓋膜?？p合關(guān)閉創(chuàng)口，術(shù)后3天均肌

6、注青霉素40萬單位以預(yù)防感染，單獨(dú)喂養(yǎng)。于處死前13日、14日頸部皮下注射網(wǎng)環(huán)素，而處死前3日、4日頸部皮下注射鈣黃綠素。40只實(shí)驗(yàn)動物分別于2、4、6、12周各處死10只，將鈦筒連同顱骨完整取下并修整后以10％中性福爾馬林固定，制作硬組織切片及石蠟切片。硬組織切片用亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色，石蠟切片HE染色。骨磨片熒光顯微鏡下觀察。亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色的切片行組織形態(tài)學(xué)及計量學(xué)觀察，通過圖像測量軟件獲取相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料，把不同組間的實(shí)

7、驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)對比分析后，得出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。HE染色行組織形態(tài)學(xué)觀察。
　　 結(jié)果：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動物術(shù)后生長恢復(fù)良好，各組動物均無死亡，傷口無炎癥無裂開，每只兔植入4個鈦筒，45只兔共植入180個鈦筒，有五只兔共12個鈦筒出現(xiàn)松動，鈦筒松動率為6.7％。
　　 2.大體標(biāo)本觀察：
　　 切開白兔頭部皮膚可見纖維軟組織將鈦筒緊密包裹，鈦筒與骨面嵌合良好，穩(wěn)固無松動脫落，鈦筒周圍顱骨骨面骨膜，肌肉重新

8、附著，纖維組織由鈦筒頂端包裹整個鈦筒。
　　 3.熒光顯微鏡下觀察：
　　 新生骨質(zhì)因附著了熒光染色劑而發(fā)出綠色及黃色熒光，各組樣品間新生骨質(zhì)形成的熒光高度和面積對照清晰，可比性良好。2周時各組新生骨發(fā)出的熒光無明顯差別；4周時rhBMP2-h/膠原膜組鈦筒上層出現(xiàn)熒光，新生骨發(fā)出的熒光總量較其余三組稍多；6周時rhBMP2-h/膠原膜組鈦筒上層熒光明顯增多，熒光總量也比其余三組多；12周時rhBMP2-h/膠原膜組鈦筒

9、內(nèi)熒光分布較其余組廣泛，熒光總量較其余三組多。
　　 4.光學(xué)顯微鏡下觀察：
　　 亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色后可見新生骨從骨面或軟組織一方向鈦筒內(nèi)長入，成熟的骨質(zhì)被染成深紅色，而類骨質(zhì)和纖維組織等被染成紫藍(lán)色。2周時新生骨量較少，四個組鈦筒上層均未見骨小梁；4周時各組鈦筒內(nèi)都可見較多新生骨小梁，其中rhBMP2-h/膠原膜組鈦筒上層有少量新生骨和類骨質(zhì)，而其它三組不明顯，rhBMP2-h/膠原膜組新生骨總量較其余三組稍多；

10、6周時rhBMP2-h/膠原膜組在鈦筒上層見到大量新生骨，且與顱骨骨面來源的新骨界限明顯，其余三組未在鈦筒上層見到明顯骨小梁，rhBMP2-h/膠原膜組新生骨總量明顯較其余三組多。12周時鈦筒內(nèi)部骨小梁生長高度增加，骨小梁增粗，鈦筒頂端出現(xiàn)了骨吸收。rhBMP2-h/膠原膜組新生骨總量較其余三組多。
　　 HE染色可以可清晰地顯示成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞、膠原等，可觀察膠原膜、早期骨小梁，能分辨骨礦化不同階段。2周時可見r

11、hBMP2-h/膠原膜組、游離rhBMP-2/膠原膜組及膠原膜組鈦筒上層的膠原膜未完全降解，rhBMP2-h/膠原膜組膜內(nèi)長入血管和成纖維細(xì)胞較其余兩組多，空白組鈦筒上層全部為纖維組織。4周時膠原膜基木被降解吸收完全，在rhBMP2-h/膠原膜組的鈦筒上層有較多類骨質(zhì)和血管組織，而在其余三組的相似部位可見大量纖維組織。6周時rhBMP2-h/膠原膜組鈦筒上層有大量骨小梁密集，骨小梁上沿較多成骨細(xì)胞及血管生成，而在其余三組類似部位未見明顯

12、骨小梁密集帶，見纖維組織長入鈦筒。12周時rhBMP2-h/膠原膜組鈦筒上層為大量成熟骨小梁。骨小梁幾乎長滿整個鈦筒，而其余三組的鈦筒上層為大量纖維組織。
　　 5.統(tǒng)計分析結(jié)果：
　　 經(jīng)析因方差分析，結(jié)果顯示不同時間段間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=68.097，P=0.000)；不同處理組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=13.868，P=0.000)；不同時間段和不同處理組兩因素間有交互作用(F=2.008，P=0.045)。這說

13、明各處理組的差異在不同時間段不一樣，即不同的BMP結(jié)合方式、有無BMP的各組間的差異在2、4、6、12周不一樣，故有必要分別于每一時間段對四個處理組進(jìn)行比較。
　　 其中，2周時rhBMP2-h/膠原膜組、游離rhBMP-2/膠原膜、膠原膜和空白組新生骨面積占整個鈦筒面積的百分比為(2.45±1.88)％、(2.18±1.81)％、(1.62±1.01)％和(1.79±2.04)％。方差分析結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.37

14、2，P=0.774)。
　　 4 周rhBMP2-h/膠原膜組、游離rhBMP-2/膠原膜、膠原膜和空白組新生骨面積百分比為(7.53±2.80)％、(6.54±2.28)％、(5.97±2.93)％和(4.74±1.51)％，方差分析結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.810，P=0.168)。
　　 6 周rhBMP2-h/膠原膜組、游離rhBMP-2/膠原膜、膠原膜和空白組新生骨面積百分比為(12.29±2.42)％

15、、(8.40±3.62)％、(7.03±1.17)％和(6.27±1.89)％。方差分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.619，P=0.000)。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較：rhBMP2-h/膠原膜組>游離rhBMP-2/膠原膜組≈膠原膜組≈空白組。
　　 12周rhBMP2-h/膠原膜組、游離rhBMP-2/膠原膜、膠原膜和空白組新生骨面積百分比為(16.50±4.75)％、(11.34±4.72)％、(10.01±2.18)％和(

16、9.12±4.06)％。方差分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.279，P=0.005)。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較：rhBMP2-h/膠原膜組>游離rhBMP-2/膠原膜組≈膠原膜組≈空白組。
　　 結(jié)論：
　　 1.兔顱骨引導(dǎo)骨再生動物模型能提供穩(wěn)定的空間觀察骨代用品的成骨效能。改進(jìn)后的引導(dǎo)骨再生動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ外佂岔敹酥蒙锬?，與臨床接近，且此動物模型操作方法簡便，創(chuàng)傷小，所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性好，可比性強(qiáng)。
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