抗菌-成骨雙效活性引導(dǎo)骨組織再生膜的制備與評(píng)價(jià).pdf

1、目的:引導(dǎo)骨組織再生膜(Guided Bone Regeneration，GBR)目前廣泛應(yīng)用于種植體周圍的骨缺損修復(fù)、牙周病的治療及其它骨折、骨缺損修復(fù)，通過其物理屏障功能將病損區(qū)與周圍組織隔離，創(chuàng)造一個(gè)有利于組織愈合、相對(duì)封閉的組織環(huán)境，避免軟組織的長入且保護(hù)新形成的骨組織。在種植體修復(fù)治療中，往往由于種植體頸部菌斑堆積等引發(fā)種植體周圍炎，而目前臨床常用的GBR膜無抗菌活性，限制了其臨床應(yīng)用。因此，本研究采用靜電紡絲技術(shù)制備具有抗菌

2、、成骨雙效活性的膠原/殼聚糖GBR膜，在隔離、引導(dǎo)成骨的同時(shí)具有長效抗菌性能。
　　方法:一、抗菌/成骨雙效GBR膜的制備和表征
　　通過靜電紡絲技術(shù)制備明膠/殼聚糖納米纖維膜及明膠/殼聚糖/納米羥基磷灰石(Nano Hydroxyapatite，nHA)納米纖維膜，利用靜電噴霧技術(shù)制備PLGA載藥微球載入抗菌成分—抗菌肽PAC-525，運(yùn)用層層電紡技術(shù)將二者復(fù)合，得到具有抗菌、成骨雙效活性的引導(dǎo)骨組織再生膜，對(duì)其進(jìn)行掃描電

3、子顯微鏡(SEM)觀察形貌并測量其纖維直徑(Fiber diameter)、測定其機(jī)械力學(xué)性能(Mechanical test)、水接觸角(WCA)以表征理化性能。使用IBM SPSS Statistics20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　二、生物相容性及成骨性能
　　體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(r-BMSC)接種于材料上1、4、7天，利用CCK-8(Cell Counting Kit-8)試劑盒測其OD值以評(píng)價(jià)材料細(xì)胞毒

4、性，并進(jìn)行掃描電子顯微鏡(SEM)、激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocalmicroscopy，LSCM)觀察，觀察細(xì)胞于材料上形貌特征及其增殖情況，同時(shí)對(duì)種植于材料表面的r-BMSC誘導(dǎo)14天，測其堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性以評(píng)價(jià)其成骨活性。
　　三、體外抗菌實(shí)驗(yàn)
　　將材料剪裁成1cm*1cm標(biāo)準(zhǔn)尺寸置于磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer

5、saline,PBS)中37℃、60rpm搖浴31天，定期半量取出上清液測其濃度以繪制其釋放曲線，并取其第一周、第四周釋放上清液測其抑菌環(huán)大小和抑菌率值以評(píng)價(jià)其對(duì)微生物的殺滅效果。
　　結(jié)果:一、抗菌/成骨雙效GBR膜的制備和表征
　　掃描電子顯微鏡觀察顯示通過靜電紡絲技術(shù)和靜電噴霧技術(shù)相結(jié)合的方法可制備出形貌優(yōu)良的納米纖維雙層膜結(jié)構(gòu)，利用SEM圖測量其纖維直徑，顯示無nHA組纖維直徑范圍為35.71-928.57nm(35

6、8.93±173.81nm)，加入nHA組纖維直徑范圍為106.19-1008.85nm(408.67±196.57nm)，nHA的加入顯著增加了纖維直徑（P＜0.05，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），對(duì)其進(jìn)行機(jī)械力學(xué)測量示無nHA組未交聯(lián)時(shí)其模量為3.15±0.57MPa，交聯(lián)后模量為5.11±0.96MPa，加入nHA組未交聯(lián)時(shí)其模量為4.97±2.43MPa，交聯(lián)后模量為7.22±1.49MPa，nHA的加入使其模量顯著提高（P＜0.05，兩

7、者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），交聯(lián)劑的引入使其模量進(jìn)一步提高（P＜0.05，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。水接觸角測試結(jié)果顯示無nHA組WCA為73.17±1.22°，加入nHA組WCA為69.53±0.31°，nHA的加入使其接觸角顯著降低（P＜0.05，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），顯示了更好的親水性。
　　二、生物相容性及成骨性能
　　CCK-8、SEM、LSCM結(jié)果顯示r-BMSC能在材料上生長良好，材料無細(xì)胞毒性，能促進(jìn)細(xì)胞生長，ALP活性檢測顯

8、示nHA的加入使材料具有優(yōu)良的骨引導(dǎo)性能。
　　三、體外抗菌實(shí)驗(yàn)
　　抗菌肽在材料中早期有一個(gè)快速釋放過程，其后經(jīng)歷緩慢釋放，在體外釋放可達(dá)31天以上，且具有良好的緩釋效果，早期（1周）有明顯抑菌環(huán)，對(duì)大腸桿菌抑菌環(huán)直徑為94.61％，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)直徑為95.08％，對(duì)細(xì)菌具有明顯殺滅作用，后期（4周）有一定抑菌環(huán)，對(duì)大腸桿菌抑菌環(huán)直徑為68.26％，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)直徑為77.36％，對(duì)細(xì)菌增殖具有顯著抑制