組織工程骨血管神經(jīng)化構(gòu)建的早期觀察.pdf

1、研究目的： 組織工程學(xué)技術(shù)為器官和組織的構(gòu)建提供了新的方法，利用組織工程學(xué)方法，采用顯微外科技術(shù)，在動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建血管神經(jīng)化的組織工程骨，并在動(dòng)物體內(nèi)修復(fù)大段骨缺損。通過(guò)對(duì)血管化神經(jīng)化的組織工程骨修復(fù)骨缺損的效果進(jìn)行觀察和評(píng)價(jià)，探討血管化神經(jīng)化在組織工程化骨構(gòu)建中的作用，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1、探討新型多孔β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate，β-TCP)作為骨組織工程支架材料的應(yīng)用效果

2、。 2、對(duì)帶血運(yùn)筋膜瓣包裹組織工程骨促血管化的過(guò)程進(jìn)行觀察研究，以探討其修復(fù)大段骨缺損的一般規(guī)律。 3、觀察不同神經(jīng)束植入組織工程骨后對(duì)成骨活動(dòng)的影響，探討組織工程骨神經(jīng)化構(gòu)建的方法。 實(shí)驗(yàn)方法： 一、新型多孔β-磷酸三鈣作為骨組織工程支架材料的實(shí)驗(yàn)研究 1．對(duì)β-TCP進(jìn)行光鏡和掃描電鏡觀察． 2．將新西蘭大白兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSC

3、s)與β-TCP復(fù)合培養(yǎng)，MTT法測(cè)定細(xì)胞增值情況以判斷其細(xì)胞相容性。 3．制造β-TCP浸提液，通過(guò)β-TCP浸提液對(duì)細(xì)胞增值的影響檢驗(yàn)其細(xì)胞毒性。 4．將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，并與β-TCP復(fù)合修復(fù)新西蘭大白兔橈骨大段骨缺損，通過(guò)組織學(xué)檢查，放射性同位素ECT測(cè)定，X線片觀察等評(píng)價(jià)其修復(fù)效果。 二、帶血運(yùn)筋膜瓣促組織工程骨修復(fù)兔大段骨缺損的早期觀察 1．將5月齡成年新西蘭大白兔12只，分別抽取

4、骨髓，提取骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，與β-磷酸三鈣復(fù)合制作組織工程骨，修復(fù)兔雙側(cè)橈骨1.5cm大段骨缺損；左側(cè)用帶血運(yùn)筋膜瓣包裹組織工程骨作為實(shí)驗(yàn)組，右側(cè)不作此處理作為對(duì)照組。 2．分別在術(shù)后2、4、6、8、12w進(jìn)行進(jìn)行大體觀察、組織學(xué)、放射學(xué)、骨密度和放射性核素骨顯像(ECT)檢測(cè)，并將所得數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 三、組織工程骨神經(jīng)化構(gòu)建方法的對(duì)比觀察研究1．將5月齡成年新西蘭大白兔30只，分別抽取骨髓，

5、提取骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，與β-磷酸三鈣復(fù)合制作組織工程骨；分別將不向類(lèi)型神經(jīng)束植入組織工程骨，進(jìn)行以下分組：A組，組織工程骨組；B組，感覺(jué)神經(jīng)束植入組；C組，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束植入組；D組，血管束(含有自主神經(jīng))植入組；E組，感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束聯(lián)合植入組。分別用于修復(fù)兔股骨1.5cm大段骨缺損。 2．各組分別在術(shù)后4、8、12w進(jìn)行放射學(xué)檢查，并在12w進(jìn)行大體標(biāo)本、組織學(xué)觀察，骨密度檢測(cè)，將數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用以比

6、較骨缺損修復(fù)情況。 結(jié)果 一、新型多孔β-磷酸三鈣作為骨組織工程支架材料的實(shí)驗(yàn)研究． 1．顯微鏡觀察β-TCP可見(jiàn)其孔徑均勻，孔孔相通。掃描電鏡可見(jiàn)材料孔內(nèi)表面光滑，球型孔徑為500±150微米，孔內(nèi)連接徑150±50微米。 2．相差顯微鏡和掃描電鏡見(jiàn)細(xì)胞與材料黏附性良好。MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組D<,570>逐漸增加，到第12d最高，β-TCP組在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(t=0

7、.599、t=2.074、t=1.401、t=1.579，P>0.563)。 3．不同濃度的β-TCP浸提液培養(yǎng)細(xì)胞后的細(xì)胞增值率均高于100％，參照細(xì)胞毒性與細(xì)胞增值率的對(duì)應(yīng)關(guān)系，認(rèn)為β-TCP的細(xì)胞毒性均為0級(jí)。 4．通過(guò)對(duì)β-TCP與細(xì)胞的復(fù)合材料修復(fù)兔橈骨大段骨缺損中組織學(xué)檢查，放射性同位素ECT測(cè)定，X線片觀察，在12w時(shí)可以修復(fù)骨缺損。 二、帶血運(yùn)筋膜瓣促組織工程骨修復(fù)兔大段骨缺損的早期觀察術(shù)后2～4

8、w是血管化的高峰期，從第4w以后的各個(gè)觀察點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組無(wú)論在血管化程度、新骨形成量、材料降解速度還是在骨缺損修復(fù)時(shí)間、骨修復(fù)改建的質(zhì)量上都優(yōu)于對(duì)照組(不同時(shí)間之間X線阻射值有顯著性差異(F=474.893，P<0.001；骨密度值有顯著性差異F=28.457，P<0.001；ROI相對(duì)值有顯著性差異F=118.106，P<0.001)。 三、組織工程骨神經(jīng)化構(gòu)建方法的對(duì)比觀察研究1．大體觀察：術(shù)后12w取材，見(jiàn)各組的骨缺損均有不同程

9、度的修復(fù)，其中，A組和C組修復(fù)情況最差，骨缺損還未完全修復(fù)，骨痂還未完全成熟，骨缺損周?chē)?jiàn)大量的纖維結(jié)締組織；而B(niǎo)組、D組和E組已完全修復(fù)骨缺損，形成大量的皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)。 2．X線片觀察：對(duì)五組X線片進(jìn)行X線阻射值分析并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同時(shí)間之間X線阻射值有顯著性差異(F=218.272，P<0.001)；在五組均如此，F(xiàn)值分別為15.081、69.034、27.532、22.675和67.572，均為P<0.001。各組

10、隨著時(shí)間的延長(zhǎng)x線阻射值逐步升高。各組間的X線阻射值有顯著性差異(F=17.242，P<0.001)。從各時(shí)間點(diǎn)看，每一時(shí)間點(diǎn)各組的X線阻射值均有顯著性差異(為P<0.010)，不同時(shí)間點(diǎn)和分組之間存在著交互效應(yīng)(F=5.630，P<0.001)。對(duì)每一時(shí)間點(diǎn)用LSD法進(jìn)行多重比較可見(jiàn)，在4w時(shí)，D組(血管束植入組)的骨修復(fù)結(jié)果好于其他4組，其他4組之間無(wú)顯著性差異；在8周、12周時(shí)，B組(感覺(jué)神經(jīng)束植入組)、D組(血管束植入組)和E組

11、(感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束聯(lián)合植入組)均優(yōu)于A組(組織工程骨組)和C組(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束植入組)，且B組、D組和E組之間無(wú)顯著性差異；A組和C組之間無(wú)顯著性。對(duì)五組X線片進(jìn)行楊氏評(píng)分分析并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同時(shí)間之間楊氏評(píng)分有顯著性差異(F=169.236，P<0.001)；在五組均如此，F(xiàn)值分別為20.758、49.340、20.758、26.263和71.827，均為P<0.001。各組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)楊氏評(píng)分逐步升高。各組間的楊氏評(píng)分有顯著

12、性差異(F=4.426，P=0.003)。從各時(shí)間點(diǎn)看，每一時(shí)間點(diǎn)各組的楊氏評(píng)分均有顯著性差異(P<0.011)，不同時(shí)間點(diǎn)和分組之間存在著交互效應(yīng)(F=4.799，P=0.005)。對(duì)每一時(shí)間點(diǎn)用LSD法進(jìn)行多重比較可見(jiàn)，在4w時(shí)，D組(血管束植入組)的骨修復(fù)結(jié)果好于其他4組，其他4組之間無(wú)顯著性差異；在8w、12w時(shí)，B組(感覺(jué)神經(jīng)束植入組)、D組(血管束植入組)和E組(感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束聯(lián)合植入組)均優(yōu)于A組(組織工程骨組)和C組(

13、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束植入組)，且B組、D組和E組之間無(wú)顯著性差異；A組和C組之間無(wú)顯著性差異。3．組織學(xué)觀察：12w時(shí)對(duì)各組標(biāo)本進(jìn)行Masson染色，見(jiàn)各組均有不同程度的骨化現(xiàn)象和β-TCP材料的降解。A組和C組仍可見(jiàn)大量和大塊的β-TCP材料未降解，材料周?chē)墓腔潭容^低；B組、D組和E組可見(jiàn)未降解β-TCP材料被骨組織分割包圍成較小的顆粒，其骨化程度均較A組和C組為優(yōu)。在各組形成的骨痂處取材，組織學(xué)染色(Masson)可見(jiàn)A組和C組骨痂成熟度

14、較低，還未見(jiàn)明顯骨板結(jié)構(gòu)，骨細(xì)胞排列無(wú)序散亂；而B(niǎo)組、D組和E組可見(jiàn)較為明顯的骨板樣結(jié)構(gòu)，骨細(xì)胞趨向有序排列，顯示了較高的骨痂成熟度。 4．骨密度檢測(cè)：12w的骨密度檢測(cè)顯示，各組均有不同程度的骨修復(fù)現(xiàn)象。從骨密度現(xiàn)象上來(lái)看，A組(組織工程骨組)和C組(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束植入組)的骨修復(fù)還不完全；B組(感覺(jué)神經(jīng)束植入組)、D組(血管束植入組)和E組(感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束聯(lián)合植入組)已經(jīng)完全修復(fù)骨缺損(圖3-14)。將各組骨缺損處的骨密度值進(jìn)

15、行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見(jiàn)各組間有顯著性差異(F=61.090，P<0.01)，LSD法進(jìn)行多重分析見(jiàn)B組(感覺(jué)神經(jīng)束植入組)、D組(血管束植入組)和E組(感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束聯(lián)合植入組)均優(yōu)于A組(組織工程骨組)和C組(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束植入組)，(P<0.01)。且B組、D組和E組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；A組和C組之間無(wú)顯著性差異。(P>0.05)。 結(jié)論 1．Β-TCP材料孔隙均勻，與細(xì)胞有很好的的黏附性，細(xì)胞相容性好，對(duì)細(xì)胞無(wú)

16、毒性，能夠修復(fù)兔的大段骨缺損，適合作骨組織工程的細(xì)胞支架材料。 2．帶血運(yùn)筋膜瓣具有明顯的促組織工程骨血管化作用。 3．帶血運(yùn)筋膜瓣的促血管化作用關(guān)鍵在于早期。 4．早期快速的血管化是組織工程骨骨化的重要影響因素。 5．神經(jīng)因素在組織工程骨骨化過(guò)程中具有重要促進(jìn)的作用。 6．神經(jīng)束植入的方法可以用來(lái)進(jìn)行組織工程骨神經(jīng)化的體內(nèi)構(gòu)建。 7．感覺(jué)神經(jīng)具有明顯的促組織工程骨成骨作用。 8．