磁共振灌注成像監(jiān)測組織工程骨血管化的實驗研究.pdf

1、1制備骨組織工程實驗用恒河猴脛骨骨缺損模型，為下一步研究提供一種標準的實驗動物模型； 2探討磁共振灌注成像監(jiān)測組織工程骨血管化的可行性及其方法學，為組織工程骨的科學研究和臨床應用提供一種無創(chuàng)、可靠的監(jiān)測手段； 3對比磁共振灌注成像、X-線、放射性核素骨顯像監(jiān)測組織工程骨血管化的特點，探討磁共振灌注成像方法的優(yōu)缺點； 4研究磁共振灌注成像結果與組織學檢查之間的關系，檢驗磁共振灌注成像方法監(jiān)測組織工程骨血管化是否確實

2、可靠。 方法 1成年雄性恒河猴12只，根據(jù)鋼板固定的位置不同隨機分為內(nèi)側(cè)組和外側(cè)組，每組6只。均于左脛骨中段制作20mm骨缺損模型，采用7孔AO鈦合金鋼板固定。術后進行大體觀察；并在6、12、24周行X-線攝片、ECT、組織學檢查；術后24周處死實驗動物，取實驗側(cè)脛腓骨進行生物力學測試，并測量對側(cè)脛骨長度、中段直徑。 2另取17只成年恒河猴，其中13只恒河猴的25個下肢隨機分為五組，每組5個，剩余4只恒河猴備用(

3、補充實驗用)，分組如下：A組：β-磷酸三鈣(β-TCP)+骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)+血管束；B組：β-TCP+血管束；C組：β-TCP+BMSCs；D組：β-TCP；E組：空白對照。從髂后上棘抽取恒河猴骨髓，用全骨髓培養(yǎng)法進行體外培養(yǎng)獲得骨髓基質(zhì)干細胞，條件培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代細胞，取第三代細胞與材料復合。血管束采用恒河猴脛骨內(nèi)側(cè)隱動靜脈分支。術后4、8、12周使用德國SIEMENS公司生產(chǎn)1.5T超導型MR成像系統(tǒng)掃描檢查，采用自旋回波

4、序列(EPI-SE)，TR9ms，TE4ms，激發(fā)角40°，矩陣256×128，掃描周期2s。使用自動高壓注射器自恒河猴前臂頭靜脈注射對比劑釓噴替酸葡甲胺(Gd-DTPA，0.2mmol/kg，3ml/s)，在開始團注對比劑的同時啟動灌注掃描程序，在80s內(nèi)成像40幅，得到一動態(tài)圖像系列。將組織工程骨中部橫斷面作為感興趣區(qū)(ROI)，由計算機自動生成信號強度-時間(SI-T)曲線和SI-T表。依據(jù)SI-T表中的數(shù)據(jù)計算ROISI-T曲線

5、的基線、最大線性斜率(SSmax)和最大信號強度上升值(MSI)。 3對第二部分實驗動物行X線檢查：術后4w、8w、12w拍攝恒河猴雙脛骨正側(cè)位X線片。拍攝條件：電壓42KV，電流100mA，曝光時間0.12s，球管距離臺面80cm。在PACs(FCR5000)影像工作站獲得電子圖像，將所得照片統(tǒng)一調(diào)節(jié)為窗位：1400，窗寬：1660。直接在工作站上測得各組骨缺損區(qū)內(nèi)的透光度。ECT檢查：術后4w、8w、12w行放射性同位素檢查

6、。GE公司HawkeyeSPECT-VG/8S型掃描儀；顯像劑：99mTc-MDP，劑量：370MBq(10mCi)；采集條件：探頭為低能高分辨準直器，能峰140kev，窗寬20％，矩陣512×512，放大1.5。恒河猴上肢前臂淺靜脈注藥4h后，采集一幅靜態(tài)顯像即延遲相，以骨缺損處1×2cm2大小的矩形為感興趣區(qū)(ROI)，同位素計數(shù)，為排除每只恒河猴注射劑量的差異，均以左側(cè)股骨中段同樣大小ROI的同位素計數(shù)為標準，將雙側(cè)脛骨骨缺損部位

7、感興趣區(qū)的同位素計數(shù)分別與之相比，求得ROI的同位素計數(shù)比值。 4第二部分實驗動物，術后4、8周，各組均取一個標本做組織學檢查(為保證每組樣本量不少于5個，將剩余的4只恒河猴補充實驗)。術后12周各組實驗動物進行墨汁灌注，在股動脈內(nèi)插管，肝素鹽水沖洗后，灌入配制好的復合墨汁(墨汁配制比例，墨汁：甲醛：生理鹽水=2∶1∶7)，取出實驗動物雙側(cè)脛骨，將生物材料連同兩端骨質(zhì)一同完整取下，放入10％甲醛溶液中固定1周，脫鈣、脫水，二甲苯

8、透明處理，石蠟包埋后在材料的橫斷面進行切片，切片厚度4μm，HE染色。采用ImageProPlus圖形分析軟件進行血管面積圖像分析。 結果 1術后第4w，外側(cè)組1例鋼板彎曲，小腿向前外側(cè)成角畸形；X線檢查：術后6w、12w、24w所有實驗動物骨缺損區(qū)均無成骨表現(xiàn)，術后24w的X線片可見骨缺損兩端硬化萎縮呈骨不連表現(xiàn)。兩組術后6w、12w、24w的透光度比較無統(tǒng)計學差異；ECT檢查：術后6w、12w、24w感興趣區(qū)(ROI

9、)同位素計數(shù)之間無顯著性性差異(P＞0.05)，攝取比值(T/NT)也無顯著性差異(P＞0.05)；組織學檢查：術后6w、12w、24w骨缺損處由大量結締組織充填。生物力學前后位三點彎曲應力測試，內(nèi)側(cè)組727.23±42.74；外側(cè)組533.06±88.04。兩者相比有統(tǒng)計學差異(P=0.014)；恒河猴脛骨數(shù)據(jù)：脛骨長度139.85±10.50mm；中段前后徑10.56±0.96mm；中段左右徑9.60±0.89mm。 2信號

10、強度-時間(SI-T)曲線最大線性斜率(SSmax)的改變：A、B兩組術后8w與4w相比均有較大幅度的提高(A組：P=0.001，B組：P=0.033)，術后8w兩組間SSmax相比，A組高于B組(P=0.010)。C、D兩組SI-T曲線的SSmax術后8w與4w相比均有提高(C組：P=0.001，D組：P=0.017)，術后12w與8w相比亦有提高(C組：P=0.042，D組：P=0.036)?？瞻讓φ盏腅組，術后12w與4wSSma

11、x相比有統(tǒng)計學意義(P=0.028)。信號強度-時間(SI-T)曲線的基線(Baseline)的改變：A組術后8w與4w相比有統(tǒng)計學意義(P=0.004)。最大信號強度上升值(MSI)的改變：術后8w，各組間除A和B兩組無統(tǒng)計學差異(P=0.246)，其他各組間對比均有統(tǒng)計學意義。 3X-線檢查，A組透光度測量：術后8w、12w下降值均有統(tǒng)計學意義(均為P=0.001)。B、C兩組12w與8w相比下降值有統(tǒng)計學意義(B組：P=0

12、.002，C組：P=0.021)。術后12wA組5個樣本的透光度與磁共振灌注成像檢查的SSmax呈負相關(r=-0.892，P=0.042)。ECT：術后8w與4w相比A、C兩組ROI同位素計數(shù)比值增高有統(tǒng)計學意義(A組：P=0.015，C組：P=0.042)。術后8w組間對比：五個組同位素計數(shù)比值相互之間均有統(tǒng)計學意義。術后8wA組5個樣本的同位素計數(shù)比值與磁共振灌注成像檢查的SSmax呈正相關關系(r=0.899，P=0.038)。

13、 4組織學檢查：術后4w，A組材料斷面中央及骨端有部分骨組織形成，臨近的材料內(nèi)也有新骨的形成；B、C兩組僅有少量骨組織可見；D組無骨組織形成。術后8w，A組可見較多骨組織形成，材料崩解；B、C兩組有部分骨組織生長；D組少量骨組織形成。E組骨缺損區(qū)為纖維結締組織充填。術后12w，A組小血管形成最多，血管周圍可見形成的大量骨組織，材料消失；B、C兩組有大量骨組織生長；D組有部分骨組織形成。E組骨缺損無任何骨組織發(fā)現(xiàn)，仍為纖維結締組織

14、充填。血管面積圖像分析：A組12w血管面積值與其磁共振灌注曲線最大線性斜率呈正相關(r=0.894，P=0.041)。 結論 1恒河猴脛骨中段20mm骨缺損模型不能自主修復成骨，符合骨組織工程動物模型的要求；鋼板脛骨內(nèi)側(cè)固定較外側(cè)固定更穩(wěn)定。 2信號強度-時間的基線和最大線性斜率是兩個重要觀察指標，能較好描述組織工程骨血管化程度。 3磁共振灌注成像具有：①成像參數(shù)多；②全程監(jiān)測；③靈敏度高④可定量分析；⑤