裝載經(jīng)RGD修飾的VEGF165和Ang-1雙基因共表達(dá)腺病毒載體的絲素多孔支架及其促血管化作用.pdf

1、加快皮膚真皮再生支架的血管化速度，是提高支架的成活率、有效引導(dǎo)真皮再生、修復(fù)全層皮膚缺損的關(guān)鍵問題。VEGF165和Ang-1是兩種重要的促血管生長因子，聯(lián)合作用既有利于促進(jìn)血管的生成，又可以使新生血管獲得穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。本文將RGD修飾的VEGF165和Ang-1雙基因共表達(dá)腺病毒載體裝載在多孔絲素支架內(nèi)，研究RGD修飾的VEGF165和Ang-1雙基因共表達(dá)腺病毒對(duì)EA.hy926細(xì)胞的感染效率；研究裝載基因載體的生物活性絲素支架體外對(duì)

2、血管內(nèi)皮細(xì)胞的感染以及對(duì)雞胚尿囊膜血管生成的促進(jìn)作用。進(jìn)一步，將裝載基因載體的絲素支架移植于大鼠的皮膚真皮缺損部位，研究支架內(nèi)目的基因的原位感染和表達(dá)，及其對(duì)血管生成、真皮再生的影響。
　　首先，用pAd.VEGF165-Ang-1和腺病毒骨架質(zhì)粒pAd.RGD同源重組得到同源重組質(zhì)粒pAd.RGD-VEGF165-Ang-1，將線性化的pAd.RGD-VEGF165-Ang-1通過Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染到QBI-

3、293A包裝細(xì)胞中得到重組腺病毒Ad.RGD-VEGF165-Ang-1。用感染復(fù)數(shù)分別為10、20、30、40、50、100、150的Ad.RGD-VEGF165-Ang-1感染EA.hy926細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，隨著感染復(fù)數(shù)的增大，熒光表達(dá)增強(qiáng)，感染效率增大，當(dāng)感染復(fù)數(shù)為50時(shí)，感染效率達(dá)到81％。
　　其次，用感染復(fù)數(shù)為50的Ad.RGD-VEGF165-Ang-1感染EA.hy926細(xì)胞，培

4、養(yǎng)1，3，5，7天。CCK-8檢測結(jié)果表明Ad.RGD-VEGF165-Ang-1感染細(xì)胞有助于促進(jìn)EA.hy926細(xì)胞的增殖。ELISA檢測VEGF和Ang-1因子分泌水平，結(jié)果表明感染Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的細(xì)胞分泌的VEGF165和Ang-1的量顯著高于未感染對(duì)照組（p<0.05），且在7天內(nèi)，隨著時(shí)間的延長，這兩種生長因子的分泌量增大。將Ad.RGD-VEGF165-Ang-1裝載在絲素多孔支架內(nèi)，掃描電鏡觀察

5、結(jié)果表明腺病毒顆粒均勻的分布在支架內(nèi)的孔壁上。在裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的絲素多孔支架內(nèi)接種細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察絲素多孔支架內(nèi)的腺病毒能夠感染接種的細(xì)胞，說明裝在絲素支架上的腺病毒能保持感染細(xì)胞的活性。將接種細(xì)胞的絲素支架用戊二醛固定，掃描電鏡觀察細(xì)胞在絲素支架內(nèi)的生長情況，可見細(xì)胞在支架表面能夠充分鋪展、增殖。雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果表明，裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的絲素多孔支架具有良好的促血管化的

6、能力。
　　進(jìn)一步，將裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的絲素多孔支架植入 SD大鼠的皮膚真皮缺損部位。HE和Masson’s染色進(jìn)行的組織學(xué)觀察結(jié)果說明，與未裝載病毒載體的支架相比，裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的多孔絲素支架移植于SD大鼠的全層皮膚缺損創(chuàng)面后，能顯著促進(jìn)支架內(nèi)部微血管的生成，促進(jìn)膠原纖維產(chǎn)生，促進(jìn)真皮組織再生。免疫組化結(jié)果表明裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的絲素多孔支架移植