hVEGF165-hBD-3雙基因修飾BMSCs及其對(duì)放創(chuàng)復(fù)合傷的促愈作用研究.pdf

1、隨著社會(huì)的發(fā)展進(jìn)步，人們對(duì)全身和局部的電離損傷的擔(dān)心愈來(lái)愈大，這些電離損傷來(lái)源于：核電站事故、惡性腫瘤治療性的輻射、長(zhǎng)時(shí)間的X線透視、核醫(yī)學(xué)中過(guò)量放射性材料的吸入、核爆炸性恐怖事件等。機(jī)體損傷后出現(xiàn)協(xié)調(diào)的愈合過(guò)程，其中包括多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)之間錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)作用。正常創(chuàng)面愈合是由旁分泌或自分泌的許多細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子介導(dǎo)和調(diào)控的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。放創(chuàng)復(fù)合傷難愈創(chuàng)面的愈合過(guò)程紊亂，修復(fù)細(xì)胞數(shù)量減少或功能受損，導(dǎo)致對(duì)創(chuàng)面愈合起

2、重要作用的生長(zhǎng)因子合成降低，膠原合成和炎性細(xì)胞減少等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derivedmesenchymAlstem cells，BMSCs）促進(jìn)傷口愈合的功能性特征包括：能夠移行到創(chuàng)傷或炎癥的部位，參與受損組織的再生與重建，刺激固有的祖細(xì)胞增殖和向不同方向分化，通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子和重新塑造細(xì)胞來(lái)促進(jìn)受損細(xì)胞的恢復(fù)，發(fā)揮特殊的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。有效地把BMSCs作為一種修復(fù)細(xì)胞和/或外源基因表達(dá)的載體來(lái)運(yùn)用于臨床

3、是目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endotheliAlgrowth factor，VEGF）的功能是作為促內(nèi)皮細(xì)胞分裂劑，趨化性媒介物和血管滲透性的誘導(dǎo)物，它是在創(chuàng)傷愈合級(jí)聯(lián)中唯一的起多重功能作用的因子，包括血管發(fā)生、內(nèi)皮形成和膠原沉積。局部微生物的持續(xù)感染也是創(chuàng)面難愈或不愈的原因之一。防御素富含正電荷，作用于細(xì)胞膜，具有廣譜高效的殺菌活性。由于其獨(dú)特的作用機(jī)制，幾乎無(wú)耐藥性，其中人β防御素3（humanbet

4、a defensins，hBD-3）在人類預(yù)防和治療感染性疾病方面發(fā)揮了重要作用，其在很小劑量范圍內(nèi)就表現(xiàn)出對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的抗菌活性，同時(shí)其抗菌活性是非鹽離子濃度敏感性的，也不引起溶血，分子量小，合成快，彌散快，不傷害人體組織細(xì)胞，是理想的抗感染的活性抗菌肽。研究顯示hBD-3的重組體和化學(xué)合成的hBD-3的抗菌性和生物學(xué)特性與分離出來(lái)的天然肽沒(méi)有區(qū)別。
　　 為了研究促進(jìn)放創(chuàng)復(fù)合傷等慢性難愈性損傷的愈合，我們構(gòu)建了pVIVO1-

5、hVEGF165-hBD-3真核質(zhì)粒載體，用于轉(zhuǎn)染大鼠的BMSCs，并將hVEGF165/hBD-3基因修飾的BMSCs移植到大鼠放創(chuàng)復(fù)合傷的傷口皮下，以期大量合成釋放hVEGF165和hBD-3，共同促進(jìn)創(chuàng)面愈合。主要方法和結(jié)果如下：
　　 1．hVEGF165/hBD-3 雙基因共表達(dá)真核質(zhì)粒載體的構(gòu)建和鑒定。利用RT-PCR 方法分別從白血病細(xì)胞（HL60）和牙齦組織中擴(kuò)增出hVEGF165和hBD-3基因片段，通過(guò)DNA

6、 重組技術(shù)將基因片段先后重組于pVIVO1-mcs 真核表達(dá)載體上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒載體pVIVO1-hVEGF165和pVIVO1-hVEGF165-hBD-3，分別用酶切電泳分析及DNA 測(cè)序的方法對(duì)重組質(zhì)粒載體進(jìn)行鑒定。運(yùn)用jetPEI 轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs后，采用RT-PCR、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和Western blot方法證實(shí)重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs后，能成功高表達(dá)外源基因hVEGF165和hBD-3。
　　

7、 2．重組質(zhì)粒pVIVO1-hVEGF165-hBD-3轉(zhuǎn)染BMSCs后表達(dá)產(chǎn)物活性鑒定。分別收集轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVIVO1-hVEGF165-hBD-3（T）、轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVIVO1-hVEGF165（C1）、轉(zhuǎn)染空載體（C2）以及正常未轉(zhuǎn)染（N）的BMSCs無(wú)血清培養(yǎng)上清，分別命名為T(mén)-CM，C1-CM，C2-CM和N-CM。為了檢測(cè)分泌出的hVEGF165能刺激細(xì)胞增殖和移行，另外設(shè)立了一組T-CM/Ab，即T-CM中加入hVEG

8、F165中和抗體，用來(lái)阻斷hVEGF165的作用效應(yīng)。
　　 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926按4×103/孔接種于含有100μL/孔完全培養(yǎng)基的96孔板中。常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔更換上述5種條件培養(yǎng)基，按CCK-8試劑盒的說(shuō)明連續(xù)檢測(cè)5d以觀察增殖效應(yīng)。結(jié)果顯示：與 C2-CM、N-CM和T-CM/Ab組相比，T-CM和C1-CM組在第1-4d能夠顯著的促進(jìn)細(xì)胞增殖（p<0.05），表明表達(dá)的外源基因hVEGF165

9、有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。將內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926接種于12孔板，待其達(dá)到95％的融合時(shí)，用一無(wú)菌的1mL移液頭，在培養(yǎng)板孔中央垂直交叉劃出一個(gè)“十”，使單層細(xì)胞形成劃痕，再用PBS沖洗2次，之后再每孔中加入1mL上述5種條件培養(yǎng)基。劃痕后0、4、8、12和18 h時(shí)用倒置顯微鏡于“十”兩側(cè)固定區(qū)域攝像。運(yùn)用圖像分析處理軟件測(cè)量愈合率。結(jié)果顯示T-CM和C1-CM組在劃痕后第4、8、12和18h的愈合率明顯高于C2-CM、N-CM和T-C

10、M/Ab組（p<0.05），表明表達(dá)的外源基因hVEGF165有促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用。對(duì)上述四種培養(yǎng)上清進(jìn)行冷凍干燥、重溶，獲取20倍濃縮液，然后采用K-B紙片法觀察其對(duì)大腸埃希菌（EC， ATCC25922）、綠膿桿菌（PA，ATCC27853）、金黃色葡萄球菌（SA，ATCC25923）、枯草芽孢桿菌（BS，ATCC62037）和白色念珠菌（真菌，CA， ATCC10231）
　　 的抗菌效應(yīng)。結(jié)果顯示，T組培養(yǎng)上清濃縮液出現(xiàn)

11、顯著抑菌環(huán)，其它組沒(méi)有抑菌環(huán)。表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs后，表達(dá)的外源基因hBD-3有抑制細(xì)菌和真菌的作用。
　　 3．重組質(zhì)粒pVIVO1-hVEGF165-hBD-3轉(zhuǎn)染BMSCs后局部移植對(duì)放創(chuàng)復(fù)合傷創(chuàng)面修復(fù)的影響。復(fù)制大鼠放創(chuàng)復(fù)合傷全層皮膚缺損創(chuàng)面，以局部點(diǎn)狀注射移植轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVIVO1-hVEGF165-hBD-3的BMSCs為T(mén)組，以注射移植轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVIVO1-hVEGF165的BMSCs為C組，以注射移植

12、正常未轉(zhuǎn)染的BMSCs為N組，以注射PBS為S組。在移植后1d、3d、7d、13d和20d，大體觀察創(chuàng)面愈合情況，同時(shí)測(cè)定殘留面積和愈合時(shí)間。各時(shí)相點(diǎn)分別取材，石蠟切片經(jīng)HE染色，觀察各組各時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面的病理形態(tài)變化；石蠟切片經(jīng)Sirius red染色后，偏振光顯微鏡下觀察膠原纖維含量的變化；免疫組織化學(xué)染色觀察外源基因hVEGF165/hBD-3和創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)層粘連蛋白（Laminin）的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，大體觀察，在各時(shí)相點(diǎn)，與C

13、、N、S組比較，T組創(chuàng)面感染程度較輕，愈合速度較快，創(chuàng)面平均愈合時(shí)間為20d，而C、N、S組的平均愈合時(shí)間是22-23、24-25和27-28d。
　　 移植術(shù)后7d、13d和20d時(shí)，T組中剩余殘留面積百分比顯著低于其它3組(P<0.05)；HE染色結(jié)果證實(shí)T組有更好的肉芽組織形成；膠原纖維Sirius red染色結(jié)果表明，T組膠原纖維含量和厚度明顯高于其它3組；創(chuàng)面免疫組織化學(xué)觀察到， T組中外源基因hVEGF165/hBD

14、-3大量表達(dá)，而且創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)反映血管基底膜形成的Laminin表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。T組與C組的差異可以推測(cè)：hBD-3在創(chuàng)傷愈合中也許發(fā)揮了一定的作用，也許與hBD-3的抗微生物的活性有關(guān)。C組與N組的差異可以推測(cè)：hVEGF165固有的促內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管發(fā)生的特性也許在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用。局部移植雙基因修飾后的BMSCs確實(shí)能促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，這也許緣于分泌促內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管發(fā)生的hVEGF165和抗微生物的hBD-3，才導(dǎo)