Ghrelin對(duì)放燒復(fù)合傷創(chuàng)面的促愈效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、放燒復(fù)合傷(combined radiation-burn injury, CRBI)是指以放射損傷為主，同時(shí)或相繼發(fā)生燒傷的一類(lèi)放射復(fù)合傷。放燒復(fù)合傷屬于軍事特種醫(yī)學(xué)的研究范疇，通常僅見(jiàn)于戰(zhàn)現(xiàn)場(chǎng)或核事故，而罕見(jiàn)于日常生活。放射性損傷是其具有較大傷害性的首要原因，而燒傷的存在增加了病情的復(fù)雜性，常表現(xiàn)為“加重效應(yīng)”。對(duì)于中度及以上的放燒復(fù)合傷，以“早期急性應(yīng)激和休克、全身急性炎性反應(yīng)、造血功能障礙、免疫抑制、胃腸道功能損傷及燒傷創(chuàng)面的延

2、遲愈合及不愈合”為主的多種病理表現(xiàn)使治療變得較為棘手。內(nèi)外源性感染是引起死亡的主要原因，而燒傷創(chuàng)面的延遲愈合或不愈合則是不斷加重的外源性感染的主要來(lái)源。因此，促進(jìn)放燒復(fù)合傷創(chuàng)面愈合有助于延緩病情發(fā)展，并提高存活率和改善預(yù)后。
　　目前對(duì)放燒復(fù)合傷的研究均限于動(dòng)物水平，其中針對(duì)創(chuàng)面愈合的研究較少且缺乏系統(tǒng)性。這些物理（如創(chuàng)面護(hù)理、切痂等），化學(xué)（如碘伏和苯妥因等）或生物（如間充質(zhì)干細(xì)胞等）治療方法雖然在一定程度上改變了創(chuàng)面的愈合狀態(tài)

3、，但對(duì)動(dòng)物整體傷情的減輕似乎并無(wú)突出貢獻(xiàn);某些方法不僅“性價(jià)比”低，還容易產(chǎn)生副作用，具有一定的應(yīng)用局限性。Ghrelin是一種內(nèi)源性多功能“腦-腸肽”，前期研究顯示ghrelin可通過(guò)減弱急性應(yīng)激反應(yīng)，減輕急性炎性反應(yīng)，促進(jìn)造血功能恢復(fù)，降低放燒復(fù)合傷大鼠死亡率，可應(yīng)用于放燒復(fù)合傷的綜合治療。Ghrelin具有合成容易、廉價(jià)易得、給藥方便等優(yōu)點(diǎn)，其對(duì)放燒復(fù)合傷動(dòng)物的救治作用，除上述機(jī)制外，推測(cè)還可能與促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合有關(guān)。因此，本課題

4、從以下幾個(gè)層次研究了ghrelin促進(jìn)放燒復(fù)合傷創(chuàng)面愈合的效應(yīng)并探討了其可能機(jī)制:
　　第一部分，ghrelin對(duì)放燒復(fù)合傷創(chuàng)面的促愈效應(yīng)觀察，研究ghrelin促進(jìn)創(chuàng)面愈合的整體效應(yīng)。
　　第二部分，ghrelin促進(jìn)放燒復(fù)合傷大鼠創(chuàng)面肉芽組織形成和成熟的研究。
　　第三部分，ghrelin促進(jìn)放燒復(fù)合傷大鼠創(chuàng)面愈合的炎癥機(jī)制研究。
　　第四部分，ghrelin與TNF-α對(duì)放燒復(fù)合傷大鼠創(chuàng)面成纖維細(xì)胞相關(guān)生物

5、學(xué)功能的影響及可能分子機(jī)制。
　　以上4個(gè)部分的研究?jī)?nèi)容均涵蓋了ghrelin在“動(dòng)物—組織—細(xì)胞—分子”各個(gè)層面上對(duì)放燒復(fù)合傷大鼠創(chuàng)面愈合的貢獻(xiàn)作用，主要表現(xiàn)為與創(chuàng)面愈合相關(guān)的炎癥機(jī)制研究。獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.放燒復(fù)合傷導(dǎo)致大鼠血清ghrelin濃度顯著下降，傷后第7d最為明顯(下降約50％)，之后逐步恢復(fù)至正常水平。50，100和200nmol·kg-1·d-1ghrelin治療組大鼠在傷后24d的平均創(chuàng)面

6、愈合率分別約為60％，50％和30％（與單純復(fù)合傷組比較，P＜0.05）;同時(shí)也縮短了創(chuàng)面閉合所需平均時(shí)間約3～8d（與單純復(fù)合傷組比較，P＜0.05）。體重影響方面，200nmol·kg-1·d-1ghrelin治療還可促進(jìn)復(fù)合傷大鼠體重增加，最高可達(dá)5％(約11g)。造血方面，在傷后3，7，14d，200nmol·kg-1·d-1ghrelin治療顯著抑制了WBC和PLT數(shù)目的減少（與單純復(fù)合傷組比較，P＜0.05）。
　　2

7、.各實(shí)驗(yàn)組大鼠創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)DNA、膠原（羥脯氨酸）、氨基己糖和總NO含量，隨著創(chuàng)面的逐漸修復(fù)，均呈現(xiàn)出先增加后減少的變化趨勢(shì);在檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，傷后第20d為含量變化最高點(diǎn)。與單純燒傷組比較，復(fù)合傷組肉芽組織內(nèi)DNA、膠原、氨基己糖和總NO含量均有顯著降低(P＜0.05)，而200nmol·kg-1·d-1ghrelin治療組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均顯著促進(jìn)了以上各項(xiàng)指標(biāo)的提升（與復(fù)合傷組比較，P＜0.05）:DNA含量在復(fù)合傷后10，20和30

8、天分別下降約67％，56％和63％，ghrelin分別提高了其含量約138％，98％和136％;膠原含量在傷后第10，20d分別下降約36％和32％，ghrelin均提高了其含量約36％;氨基己糖含量在傷后第10，20d分別下降約34％和36％，ghrelin提高其含量約26％和46％;總NO含量在第10，20d分別下降約77％和50％，ghrelin提高其含量約200％和33％。膠原天狼猩紅和Masson染色也顯示復(fù)合傷肉芽組織內(nèi)膠原

9、含量明顯低于單燒組，而ghrelin治療后其分泌水平明顯升高(P＜0.05);血管染色顯示復(fù)合傷肉芽組織內(nèi)血管形成數(shù)量明顯減少，而ghrelin治療則提高了微血管數(shù)量(P＜0.05)。WB實(shí)驗(yàn)證實(shí)生長(zhǎng)因子TGF-β和VEGF分泌水平也出現(xiàn)類(lèi)似“倒三角”變化趨勢(shì)。其次，H.E.染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)合傷肉芽組織內(nèi)WBC浸潤(rùn)量明顯低于單燒組，而ghrelin治療組WBC數(shù)目明顯增加，主要以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞為主。另外，通過(guò)對(duì)GHS-R1a進(jìn)行染色

10、發(fā)現(xiàn)，其在復(fù)合傷肉芽組織內(nèi)表達(dá)量明顯降低，而ghrelin可相對(duì)上調(diào)GHS-R1a表達(dá)。阻滯劑[D-Lys3]-GHRP-6的使用極大程度地削弱或抑制了ghrelin的上述效應(yīng)。
　　3.放燒復(fù)合傷大鼠血清中促炎介質(zhì)TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯升高（與正常組比較，P＜0.05），ghrelin治療發(fā)揮了顯著的抑制作用（與復(fù)合傷組比較，P＜0.05）。炎癥因子TNF-α是影響創(chuàng)面愈合的重要因素之一，傷

11、后1，4，7d復(fù)合傷大鼠血清TNF-α濃度分別約是正常對(duì)照組的6，24和42倍(P＜0.05)，ghrelin治療后第4，7d分別下降至原濃度的46％和61％(P＜0.05)。炎性信號(hào)分子檢測(cè)方面，通過(guò)WB對(duì)各組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞總蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):傷后第4天p38MAPK，JNK和p65NF-κB有最為顯著的磷酸化增強(qiáng)，相反GR的表達(dá)則明顯下調(diào)，ghrelin治療后前三者磷酸化明顯減弱，GR表達(dá)則顯著上調(diào)。通過(guò)使用相應(yīng)的蛋白抑制劑，在同

12、一時(shí)間點(diǎn)發(fā)現(xiàn): SB203580或SP600125單獨(dú)使用可分別抑制p38MAPK、JNK的磷酸化，而聯(lián)合使用則可同時(shí)抑制p38MAPK和JNK的磷酸化;SB203580，SB203580+SP600125均可阻礙p65NF-κB的磷酸化激活，而二者的單獨(dú)或聯(lián)合使用均可使GR表達(dá)明顯增加，聯(lián)合使用效果更好;Anti-TNF-α處理可明顯抑制p38MAPK、JNK和p65NF-κB的磷酸化激活，上調(diào)GR表達(dá)，效果類(lèi)似但不及ghrelin;

13、在同一時(shí)間點(diǎn)ghrelin、SB203580、SB203580+SP600125和anti-TNF-α還顯著降低了復(fù)合傷大鼠血清中TNF-α的分泌水平。創(chuàng)面愈合相關(guān)指標(biāo)顯示，ghrelin、SB203580、SB203580+SP600125和anti-TNF-α在傷后第24天均表現(xiàn)出更高的平均創(chuàng)面愈合率(35％～65％，P＜0.05)，且縮短了平均創(chuàng)面閉合所需時(shí)間(3～8d，P＜0.05)，但以ghrelin效果最佳。[D-Lys3]

14、-GHRP-6的使用幾乎完全抑制了ghrelin的上述作用。
　　4.GHS-R1a和α-SMA分別在復(fù)合傷大鼠創(chuàng)面成纖維細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)均有高水平表達(dá)，且分布均勻。增殖活性評(píng)價(jià)方面，不同劑量的Rat ghrelin(1-104ng/mL)均未能提高原代成纖維細(xì)胞的增殖能力;不同劑量的Rat TNF-α(1-100ng/mL)未能誘發(fā)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞存活率無(wú)明顯改變;ghrelin和TNF-α聯(lián)合作用對(duì)其增殖活性亦無(wú)明顯影響。“劃痕實(shí)

15、驗(yàn)”也顯示，1-104ng/mL的ghrelin均不能促進(jìn)“劃痕”的愈合。在ghrelin的“促膠原分泌”相關(guān)機(jī)制研究方面，發(fā)現(xiàn)以下現(xiàn)象:TGF-β(5ng/mL)可使成纖維細(xì)胞內(nèi)Smad3的磷酸化在刺激后0.5-1h顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，而TNF-α(5ng/mL)則可致Smad3的磷酸化在刺激后1-2h顯著減弱(P＜0.05); ghrelin(1、100ng/mL)對(duì)TGF-β所致Smad3磷酸化的增強(qiáng)無(wú)影響;TNF-α引起成

16、纖維細(xì)胞內(nèi)p38MAPK和JNK的磷酸化水平顯著增加(P＜0.05)，Smad3的磷酸化水平明顯降低，而經(jīng)ghrelin處理后p38MAPK和JNK的磷酸化受到明顯抑制，反之Smad3的磷酸化水平則又有所恢復(fù)。
　　綜上所述，ghrelin可加快放燒復(fù)合傷大鼠創(chuàng)面肉芽組織成熟從而劑量依賴性地促進(jìn)創(chuàng)面愈合，其可能機(jī)制主要是:改善造血功能，增加肉芽組織WBC浸潤(rùn)及相關(guān)生長(zhǎng)因子分泌，促進(jìn)新生血管形成和膠原沉積;抑制MAPK炎性信號(hào)通路，