豬Ghrelin基因質(zhì)粒對(duì)小鼠的促生長(zhǎng)效應(yīng)研究.pdf

1、采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，從豬胃組織中擴(kuò)增得到 Ghrelin基因，將其克隆到pMD18-T中，經(jīng)雙酶切初步鑒定后，將酶切下的目的基因進(jìn)一步克隆到真核表達(dá)載體PCI中，進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明：插入載體PCI中的片段為含有目的基因的核苷酸序列，真核表達(dá)重組質(zhì)粒PCI-Ghrelin-28aa 構(gòu)建成功；將構(gòu)建的PCI-Ghrelin-28aa質(zhì)粒以1mg/kg 體重肌肉注射給18～20g昆明小鼠，觀察25d內(nèi)對(duì)其體重的

2、影響，結(jié)果表明：注射5d后，實(shí)驗(yàn)組小鼠平均日增重高于對(duì)照組，且差異顯著，尤其是注射10～15d增重最為明顯；20～25d兩組日增重?zé)o差異；0～25d，質(zhì)粒組平均累積增重均高于鹽水注射組；其中0～15d、0～20d、0～25d質(zhì)粒組平均累積增重分別比鹽水組高50.5％、37.2％、28.7％。 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的豬Ghrelin與GHRH基因序列，設(shè)計(jì)了含Ghrelin信號(hào)肽及Ghrelin與GHRH部分核苷酸序列及l(fā)inker序列等

3、，共233bp的基因序列，通過(guò)基因合成的方法獲得基因片段，并將其連入克隆載體PUC57中，經(jīng)雙酶切將其克隆至PCI真核表達(dá)載體中后，經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定，證明融合豬Glarelin和GHRH基因的真核表達(dá)載體PCI-Ghrelin/GHRH構(gòu)建成功；提取PCI-Ghrelin/GHRH 質(zhì)粒并體內(nèi)轉(zhuǎn)染小鼠腿部肌肉組織，觀察25d內(nèi) PCI-Ghrelin/GHRH質(zhì)粒對(duì)小鼠體重的影響，結(jié)果表明： 0～5d，PCI-Ghrelin/G

4、HRH質(zhì)粒組平均累積增重分別比PCI-Ghrelin-28aa組、鹽水組高29.9％、67.3％；第10d后，PCI-Ghrelin/GHRH質(zhì)粒組，有部分小鼠出現(xiàn)有增重減輕現(xiàn)象，甚至生長(zhǎng)停滯甚至，直到第15d后，小鼠的生長(zhǎng)又恢復(fù)正常。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期，PCI-Ghrelin/GHRH質(zhì)粒組對(duì)小鼠的累積增重要略低于生理鹽水組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)的顯著差異，其中從15d后，PCI-Ghrelin-28aa組小鼠的累積增重均高于其他兩組，且差異顯著。

5、 以乳酸-乙醇酸共聚物為載體，采用復(fù)乳.液中蒸發(fā)法制備 PCI-Glirelin-28aa真核表達(dá)質(zhì)粒微球，微球大小與文獻(xiàn)報(bào)道相符，平均粒徑分布在2-3微米間，測(cè)得的包封率為99.27％，載藥量6.8μg/mg，回收率65.7％；將質(zhì)粒微球肌肉注射給小鼠，并記錄25d里小鼠的體重變化情況；體重統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，25 d時(shí)微球包裹質(zhì)粒組累積增重比裸質(zhì)粒紐、生理鹽水組分別高14.3％、27.9％。 結(jié)論：構(gòu)建的PCI-Ghrelin-

6、28aa基因質(zhì)粒對(duì)小鼠促生長(zhǎng)作用明顯，作用時(shí)間至少達(dá)20d，有望將其開(kāi)發(fā)成為新的促豬生長(zhǎng)的基因藥物；構(gòu)建的PCI-Ghrelin/GHRH質(zhì)粒對(duì)小鼠有明顯的增重效應(yīng)，但時(shí)間極為短暫，分析原因可能是由于GHRH與Glarelin在小鼠體內(nèi)同時(shí)大量的表達(dá)，引起GH的迅速釋放，并引起的機(jī)體本身的反饋調(diào)節(jié)，使SS也大量的釋放，導(dǎo)致后期對(duì)小鼠的生長(zhǎng)造成抑制。通過(guò)對(duì)PCI-Ghrelin-28aa質(zhì)粒微球?qū)π∈蟮纳L(zhǎng)的觀察，結(jié)論認(rèn)為，載PCI-Gh