rAAV1載體介導VEGF165基因表達促進大鼠腦缺血神經(jīng)結構與功能重塑及其機制研究.pdf

1、腦梗死是一類嚴重影響人類健康的常見疾病，且多數(shù)患者在發(fā)病后將遺留終生的神經(jīng)功能缺損癥狀，如偏癱、失語、甚至癡呆等。腦組織缺血、缺氧引起的神經(jīng)細胞死亡與神經(jīng)傳導束中斷是導致神經(jīng)功能缺失的病理基礎。神經(jīng)元再生與新生血管發(fā)生是實現(xiàn)神經(jīng)功能重塑的必要前提。研究表明，血管內皮生長因子(VEGF)具有刺激新生血管形成、促進神經(jīng)干細胞增生和神經(jīng)保護等多重效應。然而，在絕大多數(shù)情況下，腦缺血后自體內源性VEGF表達量是非常有限的，其誘導新生血管發(fā)生的數(shù)

2、量并不足以彌補血流量不足導致的腦損傷。本研究擬利用重組腺相關病毒載體(rAAV)將VEGF基因轉入腦內，增強其在腦缺血周圍區(qū)域的表達，從而起到刺激新生血管形成、改善腦組織的供血和促進自體神經(jīng)干細胞增殖的效應，并在此基礎上實現(xiàn)神經(jīng)功能的改善。 rAAV載體在CNS中具有多方面的優(yōu)勢，例如可轉導分裂后細胞如神經(jīng)元，表達持續(xù)時間長，無神經(jīng)毒性和低免疫原性等。重組2型AAV載體(rAAV2)是最早被改建為載體且在CNS中研究最多的血清型

3、，但rAAV2在CNS中具有宿主細胞類型單一、轉導范圍小等缺點。近期的研究表明，不同血清型的AAV載體在CNS呈現(xiàn)不同的轉導效率和組織親嗜性，這為進一步選擇更加優(yōu)良的轉基因載體提供了新思路。rAAV1和rAAV5載體是近年來改造技術較為成熟的轉基因載體，然而它們在CNS中的親嗜性和轉導效率尚未確定，這在一定程度上影響了人們對轉基因載體作出恰當?shù)倪x擇。因此在本研究中，首先對rAAV1、2、5載體在CNS的表達特點及轉導效率進行了研究，旨在

4、為腦缺血的基因治療選擇最佳類型的rAAV載體和可行的轉基因途徑。 本研究共分為三部分： 1、重組1、2、5型腺相關病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉導效率和細胞親嗜性的研究； 2、重組1型腺相關病毒載體rAAV1-VEGF-WPRE的構建與鑒定； 3、重組1型腺相關病毒載體介導VEGF基因表達促進大鼠腦缺血新生血管生成和神經(jīng)元再生。 結果： 1、利用體內轉基因方法和免疫熒光多重標記技術，發(fā)現(xiàn)重組1型腺相

5、關病毒不僅具有比2、5型更高的轉導效率，而且具有更廣的細胞親嗜性，是一種更適于CNS的轉基因載體；在基因轉入途徑方面，我們發(fā)現(xiàn)將rAAV1載體注射到大鼠腦室內可以轉導包括紋狀體、海馬、胼胝體、皮層等多個腦結構，這些結構恰是腦缺血的易感部位。說明以rAAV1載體經(jīng)腦室內途徑轉入VEGF基因治療大鼠腦缺血是一種可行的途徑； 2、以PCR和基因編碼測序等技術證實將目的基因VEGF165正確構建到rAAV1-VEGF-WPRE載體內，并

6、將順式作用元件WPRE成功插入到表達載體；以SDS-PAGE電泳和點雜交的方法證實所構建載體的純度和感染滴度完全符合進行體內轉導研究的要求； 3、將rAAV1-VEGF-WPRE注射到大鼠腦室內后，可以檢測出VEGF基因有明確表達，其對大鼠腦缺血再灌注損傷具有肯定的保護作用：VEGF的表達使動物的神經(jīng)功能明顯改善，腦梗死灶體積明顯減小，以免疫熒光多重標記等技術發(fā)現(xiàn)VEGF的表達不僅可以促進血管內皮細胞增殖并形成新生血管，而且可以

7、明顯改善梗死灶周圍區(qū)域的血流灌注：此外還發(fā)現(xiàn)VEGF表達可以促進室下帶等區(qū)域神經(jīng)前體細胞的增殖，這些增殖的細胞向處于缺血半暗帶的皮層和紋狀體等部位遷移。 結論： 1、與rAAV2、5相比，rAAV1載體不僅可在CNS中實現(xiàn)更為廣泛的轉導，而且轉導效率高，細胞親嗜性廣，尤其是當以rAAV1腦室內注射時可以獲得多個腦結構的有效轉導，是一種比rAAV2和rAAV5更優(yōu)越的轉基因載體，有望成為CNS疾病基因治療的理想工具。