rAAV1載體介導(dǎo)VEGF165基因表達(dá)促進(jìn)大鼠腦缺血神經(jīng)結(jié)構(gòu)與功能重塑及其機(jī)制研究.pdf

1、腦梗死是一類(lèi)嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的常見(jiàn)疾病，且多數(shù)患者在發(fā)病后將遺留終生的神經(jīng)功能缺損癥狀，如偏癱、失語(yǔ)、甚至癡呆等。腦組織缺血、缺氧引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡與神經(jīng)傳導(dǎo)束中斷是導(dǎo)致神經(jīng)功能缺失的病理基礎(chǔ)。神經(jīng)元再生與新生血管發(fā)生是實(shí)現(xiàn)神經(jīng)功能重塑的必要前提。研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)具有刺激新生血管形成、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增生和神經(jīng)保護(hù)等多重效應(yīng)。然而，在絕大多數(shù)情況下，腦缺血后自體內(nèi)源性VEGF表達(dá)量是非常有限的，其誘導(dǎo)新生血管發(fā)生的數(shù)

2、量并不足以彌補(bǔ)血流量不足導(dǎo)致的腦損傷。本研究擬利用重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)將VEGF基因轉(zhuǎn)入腦內(nèi)，增強(qiáng)其在腦缺血周?chē)鷧^(qū)域的表達(dá)，從而起到刺激新生血管形成、改善腦組織的供血和促進(jìn)自體神經(jīng)干細(xì)胞增殖的效應(yīng)，并在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)神經(jīng)功能的改善。 rAAV載體在CNS中具有多方面的優(yōu)勢(shì)，例如可轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂后細(xì)胞如神經(jīng)元，表達(dá)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)神經(jīng)毒性和低免疫原性等。重組2型AAV載體(rAAV2)是最早被改建為載體且在CNS中研究最多的血清型

3、，但rAAV2在CNS中具有宿主細(xì)胞類(lèi)型單一、轉(zhuǎn)導(dǎo)范圍小等缺點(diǎn)。近期的研究表明，不同血清型的AAV載體在CNS呈現(xiàn)不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和組織親嗜性，這為進(jìn)一步選擇更加優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因載體提供了新思路。rAAV1和rAAV5載體是近年來(lái)改造技術(shù)較為成熟的轉(zhuǎn)基因載體，然而它們?cè)贑NS中的親嗜性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率尚未確定，這在一定程度上影響了人們對(duì)轉(zhuǎn)基因載體作出恰當(dāng)?shù)倪x擇。因此在本研究中，首先對(duì)rAAV1、2、5載體在CNS的表達(dá)特點(diǎn)及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率進(jìn)行了研究，旨在

4、為腦缺血的基因治療選擇最佳類(lèi)型的rAAV載體和可行的轉(zhuǎn)基因途徑。 本研究共分為三部分： 1、重組1、2、5型腺相關(guān)病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和細(xì)胞親嗜性的研究； 2、重組1型腺相關(guān)病毒載體rAAV1-VEGF-WPRE的構(gòu)建與鑒定； 3、重組1型腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)VEGF基因表達(dá)促進(jìn)大鼠腦缺血新生血管生成和神經(jīng)元再生。 結(jié)果： 1、利用體內(nèi)轉(zhuǎn)基因方法和免疫熒光多重標(biāo)記技術(shù)，發(fā)現(xiàn)重組1型腺相

5、關(guān)病毒不僅具有比2、5型更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且具有更廣的細(xì)胞親嗜性，是一種更適于CNS的轉(zhuǎn)基因載體；在基因轉(zhuǎn)入途徑方面，我們發(fā)現(xiàn)將rAAV1載體注射到大鼠腦室內(nèi)可以轉(zhuǎn)導(dǎo)包括紋狀體、海馬、胼胝體、皮層等多個(gè)腦結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)恰是腦缺血的易感部位。說(shuō)明以rAAV1載體經(jīng)腦室內(nèi)途徑轉(zhuǎn)入VEGF基因治療大鼠腦缺血是一種可行的途徑； 2、以PCR和基因編碼測(cè)序等技術(shù)證實(shí)將目的基因VEGF165正確構(gòu)建到rAAV1-VEGF-WPRE載體內(nèi)，并

6、將順式作用元件WPRE成功插入到表達(dá)載體；以SDS-PAGE電泳和點(diǎn)雜交的方法證實(shí)所構(gòu)建載體的純度和感染滴度完全符合進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的要求； 3、將rAAV1-VEGF-WPRE注射到大鼠腦室內(nèi)后，可以檢測(cè)出VEGF基因有明確表達(dá)，其對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有肯定的保護(hù)作用：VEGF的表達(dá)使動(dòng)物的神經(jīng)功能明顯改善，腦梗死灶體積明顯減小，以免疫熒光多重標(biāo)記等技術(shù)發(fā)現(xiàn)VEGF的表達(dá)不僅可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并形成新生血管，而且可以

7、明顯改善梗死灶周?chē)鷧^(qū)域的血流灌注：此外還發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)可以促進(jìn)室下帶等區(qū)域神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖，這些增殖的細(xì)胞向處于缺血半暗帶的皮層和紋狀體等部位遷移。 結(jié)論： 1、與rAAV2、5相比，rAAV1載體不僅可在CNS中實(shí)現(xiàn)更為廣泛的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，細(xì)胞親嗜性廣，尤其是當(dāng)以rAAV1腦室內(nèi)注射時(shí)可以獲得多個(gè)腦結(jié)構(gòu)的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)，是一種比rAAV2和rAAV5更優(yōu)越的轉(zhuǎn)基因載體，有望成為CNS疾病基因治療的理想工具。