強(qiáng)制性運(yùn)動(dòng)療法促進(jìn)腦缺血后大鼠的神經(jīng)發(fā)生與功能恢復(fù)的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　中風(fēng)仍然是全球范圍內(nèi)致殘的主要原因之一。盡管有大量的康復(fù)手段的存在，但治療中風(fēng)的有效的方法仍然是有限的。腦缺血后盡管大腦有高度的可塑性，但其局部微環(huán)境并不利于其自我修復(fù)，目前強(qiáng)制性運(yùn)動(dòng)療法(constraint-inducedmovement therapy, CIMT)廣泛地應(yīng)用于康復(fù)領(lǐng)域，并被證實(shí)不僅能夠有效地促進(jìn)肢體功能恢復(fù)，還能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的改變。研究證實(shí)，CIMT能夠促進(jìn)突觸的可塑性及軸突的再生從而改

2、善大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。同時(shí)，CIMT能夠促進(jìn)側(cè)腦室下區(qū)及海馬齒狀回的新生細(xì)胞的數(shù)量，但是CIMT的相關(guān)作用機(jī)制目前尚不清楚。研究還發(fā)現(xiàn)CIMT能夠提高間質(zhì)細(xì)胞源性因子-1(Stromal cell-derivedFactor1，SDF-1)的水平，而且，SDF-1能夠提高環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosinemonophosphate，cAMP)的水平，從而激活cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被認(rèn)為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)可塑性

3、如神經(jīng)發(fā)生及軸突再生有關(guān)，我們的研究旨在腦缺血的動(dòng)物模型中進(jìn)行CIMT，探討其引起神經(jīng)功能恢復(fù)的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)及是否通過(guò)cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用，這將會(huì)使我們從細(xì)胞分子水平更深入地了解中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自我修復(fù)能力，為腦梗死的臨床康復(fù)提供理論基礎(chǔ)及治療靶點(diǎn)。研究顯示中風(fēng)與年齡密切相關(guān)，年齡是影響中風(fēng)康復(fù)的一個(gè)重要的因素。隨著年齡的增長(zhǎng)，腦的生理學(xué)和神經(jīng)化學(xué)將發(fā)生很多改變，從而導(dǎo)致?lián)p傷后老年人腦的神經(jīng)生物學(xué)改變將不同于年輕人。那么，對(duì)于老年動(dòng)

4、物的研究將更具有臨床轉(zhuǎn)化意義。然而關(guān)于CIMT在老年動(dòng)物中所引起的神經(jīng)可塑性的研究目前仍然是空白。我們的研究進(jìn)一步探討了對(duì)腦缺血后老年大鼠進(jìn)行CIMT是否能夠促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，減少細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響神經(jīng)功能的恢復(fù)。
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組:成年大鼠的實(shí)驗(yàn)采用雄性Wistar大鼠，體重200-250g，由遼寧本溪長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，隨機(jī)分為:假手術(shù)組，缺血組，缺血術(shù)后行強(qiáng)制性運(yùn)動(dòng)組（CIMT組），缺血術(shù)后行強(qiáng)制性

5、運(yùn)動(dòng)并給予蛋白激酶A(proteinkinaseA，PKA)的拮抗劑H89組（H89組）。老年大鼠的實(shí)驗(yàn)采用老年雄性SpragueDawley大鼠（18-20個(gè)月），體重600-800g，由遼寧本溪長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，隨機(jī)分為:假手術(shù)組，缺血組，缺血術(shù)后行強(qiáng)制性運(yùn)動(dòng)組（CIMT組）。
　　2、大鼠腦缺血模型的制備:采用顱內(nèi)注射內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)的方法制作腦缺血模型。根據(jù)大鼠腦解剖圖譜，用立體定位

6、的方法將ET-1注射到成年大鼠及老年大鼠大腦皮質(zhì)的運(yùn)動(dòng)區(qū)及紋狀體區(qū)域以形成局部腦缺血。
　　3、大鼠強(qiáng)制性運(yùn)動(dòng)模型的制備:腦缺血術(shù)后7天開(kāi)始采用石膏繃帶固定大鼠健側(cè)（缺血病灶同側(cè)）上肢，使其強(qiáng)制使用患側(cè)上肢的方法制作強(qiáng)制性運(yùn)動(dòng)模型，為期3周。
　　4、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）及生物素化葡聚糖胺(biotinylated dextran amine，BDA)示蹤標(biāo)記:在腦缺

7、血后2周，用立體定位的方法向成年大鼠顱內(nèi)運(yùn)動(dòng)皮層內(nèi)注射BDA進(jìn)行皮質(zhì)脊髓束的順行示蹤標(biāo)記。在腦缺血術(shù)后5-6天開(kāi)始，向成年大鼠及老年大鼠腹腔內(nèi)注射BrdU100mg/kg標(biāo)記新生細(xì)胞，每天2次，連續(xù)2天。
　　5、微量滲透泵顱內(nèi)給藥:在腦缺血術(shù)后7天，用立體定位的方法在成年大鼠頸部皮下埋置灌注PKA抑制劑H89的微量滲透泵，進(jìn)行側(cè)腦室內(nèi)持續(xù)給藥，連續(xù)14天。
　　6、行為學(xué)測(cè)試:應(yīng)用梯形平衡木行走實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行定

8、量評(píng)價(jià)。
　　7、組織切片的制備:各組動(dòng)物分別于腦缺血術(shù)后33天用多聚甲醛灌注固定，取成年大鼠腦及頸段脊髓，用冰凍切片機(jī)制作成年大鼠的腦切片(片厚30μm)及脊髓切片（片厚50μm），并制作老年大鼠的腦切片(片厚40μm)。
　　8、梗死體積的測(cè)量:使用尼氏染色測(cè)量并比較成年大鼠缺血組、CIMT組及H89組之間腦梗死體積的差異與老年大鼠缺血組、CIMT組之間腦梗死體積的差異。
　　9、免疫組化及免疫熒光染色:用免疫熒光

9、染色觀測(cè)成年大鼠梗死區(qū)域周邊NeuN/BrdU陽(yáng)性細(xì)胞及脊髓內(nèi)BDA標(biāo)記的皮質(zhì)脊髓束陽(yáng)性纖維的延伸與分支情況。用免疫熒光染色觀測(cè)老年大鼠梗死區(qū)域周邊NeuN/BrdU、GFAP/BrdU及Iba-1/BrdU陽(yáng)性細(xì)胞及側(cè)腦室下區(qū)的DCX/BrdU陽(yáng)性細(xì)胞與海馬齒狀回的DCX陽(yáng)性細(xì)胞。用TUNEL法檢測(cè)老年大鼠細(xì)胞凋亡的情況。
　　10、放射免疫法:腦缺血術(shù)后33天，使用放射免疫法檢測(cè)成年大鼠梗死周邊皮層的cAMP的水平。
　

10、　11、Western blot:腦缺血術(shù)后33天，使用Western blot法檢測(cè)成年大鼠梗死周邊皮層的PKA C-α，pCREB，PSD-95（突觸標(biāo)記物）及synaptophysin（突觸標(biāo)記物）的水平。
　　12、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS16.0 for windows進(jìn)行。應(yīng)用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)來(lái)判斷差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差或均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。<

11、br>　　結(jié)果：
　　1、梗死體積的測(cè)量。
　　成年大鼠缺血組、CIMT組及H89組之間梗死體積沒(méi)有明顯差異(P＞0.05)。老年大鼠缺血組與CIMT組之間梗死體積沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。
　　2、CIMT能夠提高成年大鼠梗死皮層cAMP的水平。
　　成年大鼠腦缺血后cAMP的水平明顯升高(P＜0.01)，CIMT組的cAMP水平與缺血組相比有所降低(P＜0.01)。
　　3、CIMT能夠提高成年大鼠

12、梗死皮層PKA C-α的水平。
　　成年大鼠腦缺血后梗死皮層核蛋白的PKA C-α的水平與假手術(shù)組比明顯降低（P＜0.01），CIMT能夠顯著提高梗死皮層核蛋白的PKA C-α的水平（P＜0.05）;假手術(shù)組、缺血組、CIMT組漿蛋白的PKA C-α的水平?jīng)]有明顯差異(P＞0.05)。
　　4、CIMT能夠促進(jìn)成年大鼠細(xì)胞核CREB磷酸化的水平。
　　成年大鼠CREB磷酸化的水平在腦缺血后有所下降（P＜0.01），CI

13、MT組較單純腦缺血組比，CREB磷酸化的水平有所增高(P＜0.01); CIMT對(duì)CREB磷酸化的促進(jìn)作用能夠被PKA抑制劑H89所拮抗(P＜0.01)。
　　5、CIMT能夠提高成年大鼠突觸標(biāo)記物synaptophysin及PSD-95的水平。
　　成年大鼠腦缺血后梗死周邊皮層的synaptophysin及PSD-95的水平明顯降低(P＜0.01)，CIMT能夠提高梗死周邊皮層的synaptophysin及PSD-95的水

14、平（P＜0.05），H89能夠逆轉(zhuǎn)這種提高(P＜0.05)。
　　6、CIMT能夠促進(jìn)成年大鼠腦缺血后BDA陽(yáng)性纖維通過(guò)脊髓灰質(zhì)聯(lián)合越過(guò)中線。
　　成年大鼠缺血組BDA陽(yáng)性纖維通過(guò)脊髓灰質(zhì)聯(lián)合越過(guò)中線的軸突的總長(zhǎng)度較假手術(shù)組相比明顯增多（P＜0.01）。CIMT組BDA陽(yáng)性纖維通過(guò)脊髓灰質(zhì)聯(lián)合越過(guò)中線的軸突的長(zhǎng)度較缺血組相比進(jìn)一步增多(P＜0.05)。H89能夠抑制這種CIMT促進(jìn)腦缺血后皮質(zhì)脊髓束再生的作用（P＜0.01）

15、。
　　7、CIMT能夠促進(jìn)成年大鼠腦缺血后梗死區(qū)域周邊的BrdU/NeuN雙染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多。
　　成年大鼠缺血組梗死周邊皮層BrdU/NeuN雙染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多(P＜0.01)，CIMT組BrdU/NeuN雙染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較缺血組進(jìn)一步增多(P＜0.01)，H89組與CIMT組相比則有所減少（P＜0.01）。
　　8、CIMT對(duì)腦缺血后成年大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　缺血后成年大鼠平衡

16、木的錯(cuò)誤百分率明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），CIMT組大鼠平衡木的錯(cuò)誤百分率明顯低于缺血組(P＜0.05)，而H89能夠拮抗CIMT的這種促進(jìn)腦缺血后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用(前爪P＜0.01;后爪P＜0.05）。
　　9、CIMT對(duì)腦缺血后老年大鼠海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖及樹(shù)突發(fā)育的影響。
　　假手術(shù)組、缺血組及CIMT組三組之間海馬齒狀回的DCX陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有明顯差異(P＞0.05)，各組之間海馬DCX陽(yáng)性細(xì)胞樹(shù)突的

17、總長(zhǎng)度也沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。
　　10、CIMT對(duì)腦缺血后老年大鼠側(cè)腦室下區(qū)新生神經(jīng)細(xì)胞的增殖、存活及分化的影響。
　　缺血組側(cè)腦室下區(qū)的BrdU/DCX陽(yáng)性細(xì)胞較假手術(shù)組明顯增多(P＜0.01)，CIMT組側(cè)腦室下區(qū)的BrdU/DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與缺血組相比進(jìn)一步增多(P＜0.01)。缺血組梗死皮層周邊的BrdU/NeuN的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組明顯增多(P＜0.01)，CIMT進(jìn)一步增加了梗死皮層周邊的BrdU/

18、NeuN的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（P＜0.01）。CIMT組Iba-1和GFAP的表達(dá)與缺血組相比沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。
　　11、CIMT對(duì)腦缺血后老年大鼠梗死周邊皮層的細(xì)胞凋亡的影響。
　　缺血組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多(P＜0.01)， CIMT組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較缺血組明顯減少(P＜0.01)。
　　12、CIMT對(duì)腦缺血后老年大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。
　　梯形平衡木行走實(shí)驗(yàn)顯示ET

19、-1造成的局部腦缺血能夠使大鼠患側(cè)肢體產(chǎn)生明顯的運(yùn)動(dòng)功能損傷（P＜0.01），CIMT組老年鼠平衡木的錯(cuò)誤百分率與缺血組相比明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、CIMT能夠促進(jìn)成年大鼠腦缺血后梗死區(qū)域周邊的細(xì)胞存活及軸突再生。
　　2、CIMT能夠促進(jìn)成年大鼠腦缺血后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。
　　3、CIMT通過(guò)cAMP/PKA/CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮其促進(jìn)腦缺血后成年大鼠神經(jīng)再生及功能恢復(fù)的作用。