意向性運動療法對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)可塑性影響的實驗研究.pdf

1、腦卒中是一種高發(fā)病率、高死亡率，并致大多數(shù)的存活者遺留不同程度的生理、認(rèn)知和心理障礙的疾病。多年來，許多學(xué)者對興奮性氨基酸受體AMPA受體在缺血性腦卒中的神經(jīng)毒性作用了解甚多。在腦缺血的急性期，普遍認(rèn)為AMPA受體亞單位GluR2表達(dá)下調(diào)或GluRl、GluR3／GluR2比值增加致Ca<'2+>內(nèi)流增多或遲發(fā)性細(xì)胞內(nèi)zn<'z+>濃度升高引起遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，但是在腦缺血急性期過后，AMPA受體發(fā)揮怎樣的作用并不清楚。 自19

2、95年Liao等人在《Nature》雜志一文中首次提出AMPA受體激活“靜默突觸”后，已將研究的焦點從AMPA的神經(jīng)毒性作用轉(zhuǎn)向AMPA的可塑性方面。目前，已在正常的神經(jīng)元細(xì)胞和組織中就AMPA受體的可塑性進行了大量的研究，認(rèn)為AMPA受體的數(shù)量和亞單位的構(gòu)成與突觸的可塑性關(guān)系密切，它能增強突觸的傳遞效能。那么在腦缺血狀態(tài)下，AMPA受體是否也具有突觸可塑性尚無文獻(xiàn)報道；在局灶性腦缺血的不同時期，AMPA受體是介導(dǎo)神經(jīng)毒性作用還是參與突

3、觸可塑性也不清楚；不同時期，缺血中心區(qū)與半暗帶AMPA受體的表達(dá)及作用機理是否有所不同還需要進一步闡明。 目的：探討AMPA受體在大鼠局灶性腦缺血不同時期缺血中心區(qū)與半暗帶AMPA受體基因及蛋白的表達(dá)，并同時觀察凋亡陽性細(xì)胞數(shù)，以進一步闡述AMPA受體在局灶性腦缺血的作用機制。 方法：選擇七周齡雄性純系，體重200～300 g左右Sprague-Dawley大鼠184只，按抽簽法隨機分成以下各組：正常對照組、假手術(shù)組、M

4、CAO組。假手術(shù)組、MCAO組分成再灌后1h、 ld、3d、7d、15d、30d組。采用線栓法建立大腦中動脈梗塞(MCAO)模型。分別采用免疫組化、RT-PCR、ninnel染色檢測各組大鼠缺血中心區(qū)與半暗帶或相應(yīng)部位AMPA受體亞單位GllaR2蛋白、GluRl～G1uR4mRNA及凋亡情況。 結(jié)果：(1)TUNNEL染色結(jié)果顯示假手術(shù)組偶見散在的凋亡陽性細(xì)胞。在缺血中心區(qū)，MCAO再灌1小時即檢測到表達(dá)非常弱但數(shù)目較多的凋

5、亡細(xì)胞，再灌l(xiāng)天后更為明顯，3天和7天凋亡細(xì)胞在數(shù)量上和表達(dá)程度上達(dá)到高峰，15天均可見大量的凋亡細(xì)胞，與健側(cè)、假手術(shù)組和正常組比較均有顯著性差異。一月后只見中心區(qū)少許凋亡細(xì)胞。在半暗帶區(qū)，MCAO再灌后3天，7天和15天在缺血中心區(qū)周邊可見少許TLJNNEL陽性細(xì)胞。(2)在缺血側(cè)中心區(qū)(ischemia coreIC)，免疫組化結(jié)果顯示再灌l(xiāng)天后G1lJR2蛋白表達(dá)開始減少，3天明顯減少甚至缺失，減少持續(xù)7—15天，與對照組比較有顯

6、著性差異。30天基本上與健側(cè)相同。在缺血半暗帶，再灌后15天G1uR2蛋白表達(dá)稍增強，再灌30天后半暗帶區(qū)GluR2蛋白表達(dá)明顯增強，與健側(cè)、假手術(shù)組和正常組比較均有顯著性差異。(3)在缺血的中心區(qū)，再灌后1天GllJR2 mRNA表達(dá)開始減少，再灌后3天達(dá)到高峰，表達(dá)減少持續(xù)到7天，再灌15天后基本恢復(fù)正常。在半暗帶區(qū)，再灌1天GluR2mRNA表達(dá)開始減少，至3天達(dá)到高峰，減少持續(xù)到再灌后15天，再灌后30天基本恢復(fù)正常。(4)在缺

7、血中心區(qū)，再灌后3天G1uRl mRNA表達(dá)下調(diào)，與健側(cè)相比有顯著性差異。在缺血半暗帶，再灌后1天GluRl mRNA下調(diào)，再灌后3天表達(dá)下調(diào)更為明顯。再灌后30天G1uRlmRNA表達(dá)上調(diào)，與假手術(shù)組和正常組比較有顯著性差異。 (5)在缺血中心區(qū)， MCAO 2小時再灌后各時間點GlLIR3 mRNA與對照組相比均未見明顯差異。在缺血半暗帶，再灌后3天出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，與健側(cè)比較有顯著性差異。再灌后15天、30天GhlR3 mRNA表

8、達(dá)上調(diào)，與健側(cè)組比較有顯著性差異。(6)在缺血中心區(qū)，MCAO 2小時再灌后3天，GluR4 mRNA表達(dá)下調(diào)，與健側(cè)比較有顯著性差異。在半暗帶，再灌后3天G1LuR4 mRNA表達(dá)下調(diào)，與對照組比較有顯著性差異。再灌后15天GluR4 mRNA表達(dá)上調(diào)，再灌30天達(dá)到高峰。 結(jié)論： (1)首次發(fā)現(xiàn)MCAO模型鼠缺血中心區(qū)AMPA受體不是凋亡的超早期啟動因子。(2)在缺血中心區(qū)和半暗帶，MCAO再灌后早期GluR2下調(diào)或Glu

9、Rl、G1uR3或GhlR4／G1uR2比值增加引起遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，GluR2蛋白水平在缺血半暗帶處于亞穩(wěn)定狀態(tài)。 (4)首次提出在MCAO再灌亞急性期，缺血中心區(qū)AMPA受體無介導(dǎo)突觸可塑性的作用，而缺血半暗帶AMPA受體可能增強了突觸的傳遞效能，從分子生物學(xué)途徑對意向性運動療法對大鼠局灶性腦缺血可塑性研究提供了理論基礎(chǔ)。 盡管意向性運動療法能明顯改善患者的運動功能，但其作用機制并不清楚。因此我們首次建立MCAO大鼠意向性

10、運動治療模式，探討意向性運動療法對MCAO大鼠的運動功能的影響及意向性運動療法的可能作用機制。研究表明AMPA受體能激活“靜默突觸”，增加突觸的傳遞效能。另外，豐富飼養(yǎng)環(huán)境能使小鼠活動增多，海馬區(qū)的G1uR2和GluR4基因表達(dá)明顯增強，從而增強突觸可塑性。那么意向性運動療法通過食物刺激誘導(dǎo)大鼠偏癱側(cè)的運動是否同樣可以改變AMPA的表達(dá)，調(diào)動可塑性機制，刺激MCA0大鼠發(fā)揮潛能，從而達(dá)到運動恢復(fù)的目的值得我們?nèi)ヌ接憽?目的：探討

11、意向性運動療法干預(yù)對MCAO再灌后大鼠各時間點運動功能及缺血中心區(qū)與半暗帶AMPA受體的影響，闡明意向性運動療法的可能機制。 方法：大鼠選擇同第一部部分。將126只Sprague-Dawley大鼠隨機分成意向性運動療法組(Willed movement WM)和飼養(yǎng)環(huán)境改變組(Environment Modification EM)。其中WM和EM組又分成再灌后3d、 7d、15d、30d組。兩組大鼠分別給予爬梯頻率、前后肢抓

12、握功能評分、神經(jīng)功能評分。大鼠模型制備及AMPA蛋白及基因檢測同第一部分。 結(jié)果：(1)MCAO再灌后各時間點WM組大鼠爬梯次數(shù)明顯多于EM組。再灌后30天，WM組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯低于MCAO組。再灌后15～30天，WM組大鼠爬梯時前肢抓握功能改善更為明顯，而后肢的抓握功能在各時間點兩組間均無明顯差別。(2)免疫組化結(jié)果顯示在缺血中心區(qū)WM組、EM組和MCAO組間GluR2蛋白表達(dá)無明顯差異。在缺血半暗帶，再灌后30天，wM組

13、GluR2蛋白表達(dá)明顯增強且陽性細(xì)胞數(shù)目也增多，與MCAO組比較有顯著性差異，而與EM組無明顯差異。(3)在缺血中心區(qū)，WM組在再灌后各時相點GluRl mRNA表達(dá)與MCAO組和EM組相比均未見明顯差異。在缺血半暗帶， WM組在再灌后15～30天GluRl mRNA表達(dá)上調(diào)，與MCAO組比較有顯著性差異，與EM組未發(fā)現(xiàn)明顯差異。(4)在缺血中心區(qū)與半暗帶，WM組、EM組和MCAO組比較GhaR3 mRNA在再灌后各時相點未見明顯差異

14、。(5)在缺血中心區(qū)，3組間在再灌后各時相點GluR4 mRNA表達(dá)未見明顯差異。在缺血半暗帶，WM組在再灌后15～30天G1uR4 mRNA表達(dá)上調(diào)與MCAO組比較有顯著性差異。EM組在再灌后15～30天GluR4 mRNA表達(dá)同樣上調(diào)，與MCAO組比較有顯著差異，但WM組和EM組在再灌各時間點GluR4 mRNA表達(dá)均未見明顯差別。 結(jié)論：(1)首次成功建立MCAO大鼠意向性運動治療模式。(2)在局灶性腦缺血亞急性期，意向性