人尿激肽原酶對局灶性腦缺血模型大鼠側枝循環(huán)影響的研究.pdf

1、目前腦血管疾病已成為危害我國中老年人身體健康和生命的主要疾病，急性腦梗死患者的死亡率和致殘率較高，嚴重威脅了人類健康。梗塞灶由缺血中心區(qū)和周圍的缺血半暗帶區(qū)組成，缺血半暗帶區(qū)內受損的神經細胞功能處于可逆狀態(tài)。如何盡快建立缺血半暗帶區(qū)的側枝循環(huán)，挽救可逆性損傷的神經元細胞，成為國內研究的熱點。 激肽系統(tǒng)廣泛存在于動物體內的多個系統(tǒng)內，其對急性缺血性腦血管疾病有保護作用。組織激肽原酶是激肽系統(tǒng)的一個重要組成部分，其通過激肽B2受體介

2、導，在腦組織急性缺血缺氧時有抗氧化、抗炎、抗凋亡、促進神經再生的作用。 人尿激肽原酶是從健康男性尿液中提取得到的蛋白水解酶，是組織激肽原酶的一種，有動物實驗證明其能顯著改善急性局灶性腦缺血實驗大鼠的神經功能損傷癥狀，減小梗塞面積，并且能減輕腦水腫。但關于人尿激肽原酶對梗塞后腦血管再通、側枝循環(huán)形成情況和神經功能再建機制還缺少詳實的實驗研究。為了解釋以上問題，本文展開了以下的研究工作。 第一部分 局灶性腦缺血再灌注大鼠模型

3、的建立 目的：用線栓法建立實驗大鼠腦缺血再灌注模型，探討線栓法能否成功的建立腦缺血再灌注實驗大鼠模型。 方法： 1.線栓法制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型及分組 選擇健康雄性SD大鼠8只，體重限制在280～350g，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心。采用Longa等改進的線栓法制作局灶性腦缺血再灌注大鼠模型(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)。栓線選擇直徑為2.4～2.6mm

4、的進口魚線。 用隨機法將8只實驗大鼠隨機分成兩組：手術組、假手術組，每組4只。假手術組實驗大鼠除不插栓線外，其余手術步驟同手術組大鼠。 2.5級4分制評分標準評定神經功能受損程度 分別在缺血再灌注術后4h，12h，24h，48h，72h對手術組、假手術組大鼠進行神經功能評分，觀察實驗大鼠術后神經功能改變情況。參考ZeaLonga的5級4分法評分標準：0分：正常，無神經損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側前爪；2分，向

5、對側轉圈；3分，向對側傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。 3.TTC染色 正常實驗大鼠腦組織TTC染色后，呈紅色；梗死區(qū)域為白色。 結果： 1.神經功能影響評定： 于缺血再灌注術后4h，12h，24h，48h，72h五個時間點觀察手術組、假手術組實驗大鼠神經功能改變情況。手術組實驗大鼠：術后靜息狀態(tài)下對側肢體不能外展，以前肢為著，肌張力下降。提尾實驗對側前肢屈曲，自發(fā)運動減少。行走時向對側轉圈，

6、嚴重者向對側傾倒，不能自發(fā)行走。術側可伴有Honer征，表現為術側眼裂、瞳孔變小。隨時間推移，以上癥狀逐漸減弱或消失。假手術組實驗大鼠術后均未出現以上神經功能損傷癥狀。 2.TTC染色： 手術組實驗大鼠TTC染色后，術側大腦半球腦組織出現白色梗死區(qū)，非術側大腦半球腦組織均為紅色。假手術組實驗大鼠腦組織TTC染色后未見白色梗死區(qū)。 結論：線栓法能夠成功的建立局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，為下一步實驗奠定了基礎。

7、 第二部分 人尿激肽原酶對局灶性腦缺血再灌注大鼠側枝循環(huán)形成影響的研究 目的：探討人尿激肽原酶對局灶性腦缺血再灌注大鼠側枝循環(huán)形成有無影響。 方法： 1.建立局灶性腦缺血再灌注大鼠模型及分組 選擇健康雄性SD大鼠56只，體重限制在280～350g，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心。用隨機法將56只SD大鼠分為三組：假手術組(SH)、生理鹽水組(NS)、人尿激肽原酶組(HUK)。其中生理鹽水組、人尿激肽原酶組

8、各24只大鼠，分別于缺血90min再灌注6h、12h、24h、72h、7d取腦，24h時間點8只大鼠(4只取腦后行TTC染色、另外4只取腦后作冰凍切片行免疫組化及HE染色)，余時間點各4只大鼠(取腦后行免疫組化及HE染色)；假手術組8只大鼠(4只取腦后行TTC染色，另外4只取腦后行免疫組化及HE染色)，術后24h取腦。 人尿激肽原酶組、生理鹽水組實驗大鼠于缺血再灌注3h、后每天一次經大鼠尾靜脈分別給予人尿激肽原酶或生理鹽水。人尿

9、激肽原酶組試驗大鼠給藥劑量：將人尿激肽原酶用生理鹽水稀釋成17.5×10-3PNAU/ml，用藥量為1.0ml/kg；生理鹽水組實驗大鼠用藥劑量亦為1.0ml/kg；假手術組不給予尾靜脈給藥。 2.神經功能評定 參考ZeaLonga的5級4分法評分標準，分別在缺血再灌注術后4h，12h，24h，48h，72h五個時間點，對三組實驗大鼠進行神經功能評分。觀察三組實驗大鼠在不同時間點神經功能損傷程度有無差別。 3.T

10、TC染色及腦梗死體積測定 TTC染色后，應用HPIAS21000病理圖文分析系統(tǒng)測量各層面積及腦梗死面積，由公式： V=∑(A1+A2)t/2(其中t為切片厚度，A1和A2分別表示切塊嘴、尾側梗死面積)換算出梗死體積。 4.HE染色、光鏡檢查 5.VEGF、f8因子相關抗體免疫組化 采用免疫組化ABC方法染色。將抗VEGF多克隆抗體按1:100稀釋；抗f8因子抗體按1:200稀釋。 6.統(tǒng)

11、計學分析 所有數據均采用SPSS11.0軟件處理，實驗數據以x±s表示。 ①析因分析統(tǒng)計學方法：實驗大鼠半暗帶區(qū)VEGF免疫組化染色陽性細胞計數、半暗帶區(qū)VEGF免疫組化染色陽性血管計數及f8免疫組化染色陽性血管計數結果分析。 ②兩樣本t檢驗統(tǒng)計學方法：實驗大鼠腦梗死體積測量結果分析。 ③非參數檢驗統(tǒng)計學方法：實驗大鼠神經功能影響評分評定結果分析。 結果： 1.神經功能影響評定結果

12、 人尿激肽原酶組和生理鹽水組實驗大鼠間神經功能評分有顯著性差異。缺血再灌注4h、12h、72h人尿激肽原酶組與生理鹽水組實驗大鼠間神經功能評分無顯著差異，P>0.05：缺血再灌注24h、48h人尿激肽原酶組與生理鹽水組實驗大鼠間神經功能評分有顯著差異，P<0.05。人尿激肽原酶可以在缺血早期減輕缺血再灌注實驗大鼠的神經功能損傷程度。 2.TTC染色、腦梗死體積測定結果 人尿激肽原酶組和生理鹽水組實驗大鼠術側大腦半球腦組織

13、出現白色梗塞區(qū)，非術側大腦半球腦組織呈現鮮紅色。但人尿激肽原酶組實驗大鼠術側大腦半球腦組織白色梗死區(qū)范圍較生理鹽水組小。假手術組實驗大鼠雙側大腦半球腦組織均無白色梗死區(qū)。 人尿激肽原酶組與生理鹽水組實驗大鼠腦組織梗塞體積間有顯著性差異，P<0.05。 3.光鏡檢查結果 人尿激肽原酶組實驗大鼠術側大腦半球腦組織，于缺血再灌注6h、12h見大腦皮層錐體細胞略有腫大，胞漿淡染；缺血再灌注24h，部分錐體細胞縮小，胞核深

14、染，膠質細胞增生；缺血再灌注72h，出現嚴重的細胞死亡，缺血中心區(qū)組織疏松，形似海綿狀，表現為神經細胞胞體溶解，胞漿淡染，胞核固縮，梗死灶周圍膠質細胞明顯增多；缺血再灌注7d，部分細胞體積縮小，胞漿及胞核濃染，膠質細胞增生，可見新生毛細血管。生理鹽水組實驗大鼠各實驗時間點腦組織損傷表現同人尿激肽原酶組，但損傷程度均重于人尿激肽原酶組。假手術組實驗大鼠腦組織光鏡下未見異常。 4.VEGF、f8因子相關抗體免疫組化染色及圖像分析結果

15、 ①人尿激肽原酶組實驗大鼠腦組織梗塞中心和梗塞周邊均有VEGF免疫陽性表達細胞，非缺血側大腦組織無陽性表達細胞，表達VEGF的細胞為神經細胞、膠質細胞和巨噬細胞，72h后梗塞中心區(qū)以膠質細胞表達為主，72h、7d有大量新生血管內皮細胞表達VEGF。隨著缺血時間的延長陽性表達細胞增多，24h進入表達高峰期，7d表達減少。生理鹽水組VEGF表達的規(guī)律同人尿激肽原酶組，但在各時間點VEGF表達陽性細胞數均低于人尿激肽原酶組，兩組間差異

16、有顯著差異，P<0.05。假手術組實驗大鼠腦組織無VEGF陽性表達細胞。 ②人尿激肽原酶組實驗大鼠腦組織梗塞中心及梗塞周邊f(xié)8因子陽性表達血管數6h開始減少，隨著再灌注損傷時間的延長f8因子陽性表達血管數繼續(xù)減少，至72h表達開始增加。生理鹽水組f8因子免疫組化染色表達規(guī)律同人尿激肽原酶組，但其表達水平低于人尿激肽原酶組。人尿激肽原酶組與生理鹽水組實驗大鼠f8免疫組化染色陽性表達血管計數間差異有顯著性意義，P<0.05。假手術組