人尿激肽原酶對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠側(cè)枝循環(huán)影響的研究.pdf

1、目前腦血管疾病已成為危害我國(guó)中老年人身體健康和生命的主要疾病，急性腦梗死患者的死亡率和致殘率較高，嚴(yán)重威脅了人類(lèi)健康。梗塞灶由缺血中心區(qū)和周?chē)娜毖氚祹^(qū)組成，缺血半暗帶區(qū)內(nèi)受損的神經(jīng)細(xì)胞功能處于可逆狀態(tài)。如何盡快建立缺血半暗帶區(qū)的側(cè)枝循環(huán)，挽救可逆性損傷的神經(jīng)元細(xì)胞，成為國(guó)內(nèi)研究的熱點(diǎn)。 激肽系統(tǒng)廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)的多個(gè)系統(tǒng)內(nèi)，其對(duì)急性缺血性腦血管疾病有保護(hù)作用。組織激肽原酶是激肽系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，其通過(guò)激肽B2受體介

2、導(dǎo)，在腦組織急性缺血缺氧時(shí)有抗氧化、抗炎、抗凋亡、促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。 人尿激肽原酶是從健康男性尿液中提取得到的蛋白水解酶，是組織激肽原酶的一種，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其能顯著改善急性局灶性腦缺血實(shí)驗(yàn)大鼠的神經(jīng)功能損傷癥狀，減小梗塞面積，并且能減輕腦水腫。但關(guān)于人尿激肽原酶對(duì)梗塞后腦血管再通、側(cè)枝循環(huán)形成情況和神經(jīng)功能再建機(jī)制還缺少詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)研究。為了解釋以上問(wèn)題，本文展開(kāi)了以下的研究工作。 第一部分 局灶性腦缺血再灌注大鼠模型

3、的建立 目的：用線栓法建立實(shí)驗(yàn)大鼠腦缺血再灌注模型，探討線栓法能否成功的建立腦缺血再灌注實(shí)驗(yàn)大鼠模型。 方法： 1.線栓法制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型及分組 選擇健康雄性SD大鼠8只，體重限制在280～350g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。采用Longa等改進(jìn)的線栓法制作局灶性腦缺血再灌注大鼠模型(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)。栓線選擇直徑為2.4～2.6mm

4、的進(jìn)口魚(yú)線。 用隨機(jī)法將8只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成兩組：手術(shù)組、假手術(shù)組，每組4只。假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)大鼠除不插栓線外，其余手術(shù)步驟同手術(shù)組大鼠。 2.5級(jí)4分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定神經(jīng)功能受損程度 分別在缺血再灌注術(shù)后4h，12h，24h，48h，72h對(duì)手術(shù)組、假手術(shù)組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，觀察實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)后神經(jīng)功能改變情況。參考ZeaLonga的5級(jí)4分法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：正常，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向

5、對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。 3.TTC染色 正常實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織TTC染色后，呈紅色；梗死區(qū)域?yàn)榘咨?結(jié)果： 1.神經(jīng)功能影響評(píng)定： 于缺血再灌注術(shù)后4h，12h，24h，48h，72h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察手術(shù)組、假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)功能改變情況。手術(shù)組實(shí)驗(yàn)大鼠：術(shù)后靜息狀態(tài)下對(duì)側(cè)肢體不能外展，以前肢為著，肌張力下降。提尾實(shí)驗(yàn)對(duì)側(cè)前肢屈曲，自發(fā)運(yùn)動(dòng)減少。行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，

6、嚴(yán)重者向?qū)?cè)傾倒，不能自發(fā)行走。術(shù)側(cè)可伴有Honer征，表現(xiàn)為術(shù)側(cè)眼裂、瞳孔變小。隨時(shí)間推移，以上癥狀逐漸減弱或消失。假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)后均未出現(xiàn)以上神經(jīng)功能損傷癥狀。 2.TTC染色： 手術(shù)組實(shí)驗(yàn)大鼠TTC染色后，術(shù)側(cè)大腦半球腦組織出現(xiàn)白色梗死區(qū)，非術(shù)側(cè)大腦半球腦組織均為紅色。假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織TTC染色后未見(jiàn)白色梗死區(qū)。 結(jié)論：線栓法能夠成功的建立局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

7、 第二部分 人尿激肽原酶對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠側(cè)枝循環(huán)形成影響的研究 目的：探討人尿激肽原酶對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠側(cè)枝循環(huán)形成有無(wú)影響。 方法： 1.建立局灶性腦缺血再灌注大鼠模型及分組 選擇健康雄性SD大鼠56只，體重限制在280～350g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。用隨機(jī)法將56只SD大鼠分為三組：假手術(shù)組(SH)、生理鹽水組(NS)、人尿激肽原酶組(HUK)。其中生理鹽水組、人尿激肽原酶組

8、各24只大鼠，分別于缺血90min再灌注6h、12h、24h、72h、7d取腦，24h時(shí)間點(diǎn)8只大鼠(4只取腦后行TTC染色、另外4只取腦后作冰凍切片行免疫組化及HE染色)，余時(shí)間點(diǎn)各4只大鼠(取腦后行免疫組化及HE染色)；假手術(shù)組8只大鼠(4只取腦后行TTC染色，另外4只取腦后行免疫組化及HE染色)，術(shù)后24h取腦。 人尿激肽原酶組、生理鹽水組實(shí)驗(yàn)大鼠于缺血再灌注3h、后每天一次經(jīng)大鼠尾靜脈分別給予人尿激肽原酶或生理鹽水。人尿

9、激肽原酶組試驗(yàn)大鼠給藥劑量：將人尿激肽原酶用生理鹽水稀釋成17.5×10-3PNAU/ml，用藥量為1.0ml/kg；生理鹽水組實(shí)驗(yàn)大鼠用藥劑量亦為1.0ml/kg；假手術(shù)組不給予尾靜脈給藥。 2.神經(jīng)功能評(píng)定 參考ZeaLonga的5級(jí)4分法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分別在缺血再灌注術(shù)后4h，12h，24h，48h，72h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)三組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。觀察三組實(shí)驗(yàn)大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能損傷程度有無(wú)差別。 3.T

10、TC染色及腦梗死體積測(cè)定 TTC染色后，應(yīng)用HPIAS21000病理圖文分析系統(tǒng)測(cè)量各層面積及腦梗死面積，由公式： V=∑(A1+A2)t/2(其中t為切片厚度，A1和A2分別表示切塊嘴、尾側(cè)梗死面積)換算出梗死體積。 4.HE染色、光鏡檢查 5.VEGF、f8因子相關(guān)抗體免疫組化 采用免疫組化ABC方法染色。將抗VEGF多克隆抗體按1:100稀釋?zhuān)豢筬8因子抗體按1:200稀釋。 6.統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.0軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。 ①析因分析統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)大鼠半暗帶區(qū)VEGF免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)、半暗帶區(qū)VEGF免疫組化染色陽(yáng)性血管計(jì)數(shù)及f8免疫組化染色陽(yáng)性血管計(jì)數(shù)結(jié)果分析。 ②兩樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)大鼠腦梗死體積測(cè)量結(jié)果分析。 ③非參數(shù)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)功能影響評(píng)分評(píng)定結(jié)果分析。 結(jié)果： 1.神經(jīng)功能影響評(píng)定結(jié)果

12、 人尿激肽原酶組和生理鹽水組實(shí)驗(yàn)大鼠間神經(jīng)功能評(píng)分有顯著性差異。缺血再灌注4h、12h、72h人尿激肽原酶組與生理鹽水組實(shí)驗(yàn)大鼠間神經(jīng)功能評(píng)分無(wú)顯著差異，P>0.05：缺血再灌注24h、48h人尿激肽原酶組與生理鹽水組實(shí)驗(yàn)大鼠間神經(jīng)功能評(píng)分有顯著差異，P<0.05。人尿激肽原酶可以在缺血早期減輕缺血再灌注實(shí)驗(yàn)大鼠的神經(jīng)功能損傷程度。 2.TTC染色、腦梗死體積測(cè)定結(jié)果 人尿激肽原酶組和生理鹽水組實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)側(cè)大腦半球腦組織

13、出現(xiàn)白色梗塞區(qū)，非術(shù)側(cè)大腦半球腦組織呈現(xiàn)鮮紅色。但人尿激肽原酶組實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)側(cè)大腦半球腦組織白色梗死區(qū)范圍較生理鹽水組小。假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)大鼠雙側(cè)大腦半球腦組織均無(wú)白色梗死區(qū)。 人尿激肽原酶組與生理鹽水組實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織梗塞體積間有顯著性差異，P<0.05。 3.光鏡檢查結(jié)果 人尿激肽原酶組實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)側(cè)大腦半球腦組織，于缺血再灌注6h、12h見(jiàn)大腦皮層錐體細(xì)胞略有腫大，胞漿淡染；缺血再灌注24h，部分錐體細(xì)胞縮小，胞核深

14、染，膠質(zhì)細(xì)胞增生；缺血再灌注72h，出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞死亡，缺血中心區(qū)組織疏松，形似海綿狀，表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞胞體溶解，胞漿淡染，胞核固縮，梗死灶周?chē)z質(zhì)細(xì)胞明顯增多；缺血再灌注7d，部分細(xì)胞體積縮小，胞漿及胞核濃染，膠質(zhì)細(xì)胞增生，可見(jiàn)新生毛細(xì)血管。生理鹽水組實(shí)驗(yàn)大鼠各實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)腦組織損傷表現(xiàn)同人尿激肽原酶組，但損傷程度均重于人尿激肽原酶組。假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織光鏡下未見(jiàn)異常。 4.VEGF、f8因子相關(guān)抗體免疫組化染色及圖像分析結(jié)果

15、 ①人尿激肽原酶組實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織梗塞中心和梗塞周邊均有VEGF免疫陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，非缺血側(cè)大腦組織無(wú)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，表達(dá)VEGF的細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，72h后梗塞中心區(qū)以膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)為主，72h、7d有大量新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF。隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞增多，24h進(jìn)入表達(dá)高峰期，7d表達(dá)減少。生理鹽水組VEGF表達(dá)的規(guī)律同人尿激肽原酶組，但在各時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均低于人尿激肽原酶組，兩組間差異

16、有顯著差異，P<0.05。假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織無(wú)VEGF陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。 ②人尿激肽原酶組實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織梗塞中心及梗塞周邊f(xié)8因子陽(yáng)性表達(dá)血管數(shù)6h開(kāi)始減少，隨著再灌注損傷時(shí)間的延長(zhǎng)f8因子陽(yáng)性表達(dá)血管數(shù)繼續(xù)減少，至72h表達(dá)開(kāi)始增加。生理鹽水組f8因子免疫組化染色表達(dá)規(guī)律同人尿激肽原酶組，但其表達(dá)水平低于人尿激肽原酶組。人尿激肽原酶組與生理鹽水組實(shí)驗(yàn)大鼠f8免疫組化染色陽(yáng)性表達(dá)血管計(jì)數(shù)間差異有顯著性意義，P<0.05。假手術(shù)組