運(yùn)動(dòng)康復(fù)治療對局灶腦梗死大鼠腦可塑性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 經(jīng)顱磁刺激、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對局灶腦梗死大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響 目的：探討經(jīng)顱磁刺激、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對局灶腦梗死大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。 方法：試驗(yàn)一：健康雄性SD大鼠應(yīng)用大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞法制造大鼠局灶性腦梗死模型，將36只造模成功并存活到規(guī)定時(shí)間的大鼠隨機(jī)分為自然恢復(fù)組、低頻低強(qiáng)度經(jīng)顱磁刺激組(TMS1組)、高頻高強(qiáng)度經(jīng)顱磁刺激組(TMS2組)；分別給予常規(guī)飼養(yǎng)、0.5Hz，70％最大輸出強(qiáng)度經(jīng)顱磁刺激和1Hz，

2、100％最大輸出強(qiáng)度經(jīng)顱磁刺激。每次連續(xù)刺激30次；每天刺激2遍，共刺激4w。試驗(yàn)二：應(yīng)用MCAO法制造大鼠局灶腦梗死模型，將48只造模成功并存活到規(guī)定時(shí)間的大鼠隨機(jī)分為自然恢復(fù)組(A組)、TMS組(B組)、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(C組)和TMS+運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(D組)，每組各12只。分別給予常規(guī)飼養(yǎng)、0.5Hz，70％最大輸出強(qiáng)度經(jīng)顱磁刺激、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練、0.5Hz，70％最大輸出強(qiáng)度經(jīng)顱磁刺激+運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，共4w。 結(jié)果：試驗(yàn)一：治療后3w和4w

3、時(shí)TMS1組和TMS2組Bederson神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于自然恢復(fù)組(P＜0.05)，而這兩組間Bederson神經(jīng)功能評(píng)分無顯著性差異；刺激過程中，TMS1組和TMS2組動(dòng)物均有驚恐的表現(xiàn)，以TMS2組動(dòng)物表現(xiàn)更為明顯，TMS2組動(dòng)物刺激過程中有一例出現(xiàn)抽搐，持續(xù)約兩分鐘。試驗(yàn)二：Bederson評(píng)分：治療后3w各治療組Bederson評(píng)分明顯高于A組，以D組最為明顯(P＜0.01)；治療后4w，C、D兩組Bederson評(píng)分明顯低

4、于A組，尤以D組最為明顯(P＜0.01)。平衡木試驗(yàn)：治療后2w和3w時(shí)，C、D兩組評(píng)分明顯低于A組，尤以D組最為明顯(P＜0.01)；治療后4w時(shí)，各治療組評(píng)分明顯低于A組(P＜0.01)。治療2w時(shí)D組評(píng)分明顯低于B組，在治療4w時(shí)D組評(píng)分也低于C組。轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)：自治療2w開始，D組評(píng)分即明顯低于A組，治療后3w時(shí)C組評(píng)分也明顯低于A組。網(wǎng)屏試驗(yàn)：治療后1w和2w時(shí)C、D組網(wǎng)屏評(píng)分明顯低于A組，治療2w時(shí)B組評(píng)分也明顯低于A組?？傇u(píng)分

5、：以上各組指標(biāo)總評(píng)分，治療1w后各治療組總評(píng)分即明顯低于模型對照組；治療2w后D組總評(píng)分即明顯低于B組和C組；治療2w和3w時(shí)C組總評(píng)分明顯明顯低于B組。腦組織的病理變化：四組動(dòng)物缺血4w時(shí)HE染色光鏡下腦缺血區(qū)均見大量神經(jīng)元缺失、細(xì)胞核固縮、裂解，膠質(zhì)細(xì)胞及膠質(zhì)纖維增生、囊狀壞死等。各組大鼠左側(cè)感覺運(yùn)動(dòng)皮層區(qū)死亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)分別為(31.5％±8.4％)、(33.7％±9.7％)、(32.6％±9.4％)和(33.3％±10.7％)，

6、四組相比差異無顯著性意義(P＞0.05)。 結(jié)論：1、0.5Hz，70％最大輸出強(qiáng)度和1Hz，100％最大輸出強(qiáng)度的TMS對局灶性腦梗死大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)均有明顯促進(jìn)作用。2、TMS、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對局灶性腦梗死大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)均有明顯促進(jìn)作用，二者聯(lián)合應(yīng)用效果更為明顯。 第二部分 經(jīng)顱磁刺激、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對局灶腦梗死大鼠缺血周邊區(qū)生長相關(guān)蛋白-43(GAP-43)和突觸素(Syp)表達(dá)的影響 目的：觀察經(jīng)顱磁刺激、

7、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞后缺血周邊區(qū)生長相關(guān)蛋白-43和突觸素表達(dá)的影響。 方法：選擇成年健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組5只(A組)，常規(guī)飼養(yǎng)7d取材；其余制造大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，將造模成功、符合入選條件并存活的100只大鼠再隨機(jī)分為自然恢復(fù)組(B組)、TMS組(C組)、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(D組)和TMS+運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(E組)，每組各25只，TMS組在MCAO后24h給予TMS治療，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組在MCAO后24h給予運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，T

8、MS+運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組在MCAO后24h給予TMS+運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練；自然恢復(fù)組常規(guī)飼養(yǎng)；以免疫組化及圖像分析技術(shù)檢測正常對照組及各缺血組腦缺血后1d、3d、7d、14d、28d缺血周邊區(qū)GAP-43和Syp的表達(dá)。 結(jié)果：正常對照組大鼠在皮質(zhì)和部分腦區(qū)GAP-43均有表達(dá)，雙側(cè)對稱。其中皮質(zhì)、海馬及第三腦室周圍灰質(zhì)GAP-43的免疫活性高于其他部位，呈小點(diǎn)狀或細(xì)顆粒狀沉積。在丘腦及其腦白質(zhì)區(qū)GAP-43表達(dá)很低。缺血各組大鼠在紋狀體背外側(cè)梗

9、死中心區(qū)未見GAP-43表達(dá)，梗死周邊區(qū)GAP-43的免疫活性于缺血后1d即輕度升高，第7d達(dá)到高峰，第14d降低，第28d恢復(fù)到正常對照組水平；C組、D組和E組動(dòng)物在7d、14d時(shí)腦缺血周邊區(qū)GAP-43免疫活性明顯高于B組，其中E組動(dòng)物術(shù)后3d和7d時(shí)腦缺血周邊區(qū)GAP-43免疫活性明顯其余三組。Syp在正常對照組皮層，紋狀體及海馬處可見表達(dá)，Syp陽性物在神經(jīng)細(xì)胞表面排列成環(huán)狀或半弧形，胞漿中僅有較弱的反應(yīng)，在神經(jīng)纖維間排列呈大小

10、不一、不規(guī)則團(tuán)塊狀，少數(shù)沿神經(jīng)纖維兩側(cè)排列呈線狀，呈棕黃色；缺血各組梗死灶中心區(qū)無明顯Syp陽性染色。B組：梗死灶周邊區(qū)表達(dá)于1d表達(dá)減少，3d達(dá)最低值，7d開始增高但不及正常表達(dá)數(shù)值，14d、28d表達(dá)明顯高于正常對照組。病灶對側(cè)對應(yīng)區(qū)表達(dá)增加。C組、D組和E組動(dòng)物在缺血后14d缺血周邊區(qū)Syp表達(dá)明顯高于B組，D組和E組動(dòng)物在缺血后28d缺血周邊區(qū)Syp表達(dá)也明顯高于B組。 結(jié)論：TMS、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可促進(jìn)大鼠腦梗死后缺血周邊區(qū)

11、GAP-43和Syp的表達(dá)，具有促進(jìn)突觸再建和增強(qiáng)、完善再建突觸效能的作用，二者聯(lián)合應(yīng)用作用更為明顯。 第三部分 經(jīng)顱磁刺激、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對大鼠局灶腦缺血后微血管新生的影響 目的：觀察經(jīng)顱磁刺激(TMS)、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對大鼠腦缺血周邊區(qū)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)和毛細(xì)血管新生的影響。 方法：選擇成年健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組5只(A組)，常規(guī)飼養(yǎng)7d取材；其余制造大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型(MCAO)，

12、將造模成功、符合入選條件并存活的100只大鼠再隨機(jī)分為自然恢復(fù)組(B組)、TMS組(C組)、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(D組)和TMS+運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(E組)，每組各25只，TMS組在MCAO后24h給予TMS治療，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組在MCAO后1d給予運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，TMS+運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組在MCAO后1d給予TMS+運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練；自然恢復(fù)組常規(guī)飼養(yǎng)；以免疫組化及圖像分析技術(shù)檢測正常對照組及各缺血組腦缺血后1d、3d、7d、14d、28d缺血周邊區(qū)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表

13、達(dá)和毛細(xì)血管新生情況。 結(jié)果：正常對照組動(dòng)物僅見極弱VEGF表達(dá)，自然恢復(fù)組和各治療組大鼠缺血周邊區(qū)腦組織在缺血1d時(shí)VEGF開始表達(dá)，3d達(dá)高峰，此后開始減少，7d時(shí)仍有表達(dá)，14d時(shí)表達(dá)基本恢復(fù)正常，其對側(cè)非缺血腦組織自缺血1d后亦開始有少量VEGF表達(dá)，但明顯少于病變側(cè)，7d時(shí)表達(dá)恢復(fù)正常。各時(shí)間點(diǎn)VEGF的表達(dá)主要集中在梗死灶周圍，梗死灶中心僅見少量VEGF蛋白表達(dá)。表達(dá)細(xì)胞主要為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其次為神經(jīng)細(xì)胞及血管周圍。

14、3d和7d時(shí)治療各組VEGF在缺血周邊區(qū)的表達(dá)明顯高于B組，以E組最為明顯，14d時(shí)E組VEGF表達(dá)明顯高于B、C、D組，差別有顯著性意義，Ⅷ因子免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，微血管形態(tài)不規(guī)則，管腔由染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞圍成。C、D、E組動(dòng)物缺血14d和28d時(shí)缺血周邊區(qū)可見較多散在的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞，而A、B兩組動(dòng)物相應(yīng)部位僅見少量散在的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞。微血管計(jì)數(shù)：缺血14d和28d時(shí)缺血周邊區(qū)模型組和各治療組明顯多于正常對照組，差異有顯著性意

15、義；而E組28d時(shí)缺血周邊區(qū)微血管計(jì)數(shù)明顯多于相應(yīng)時(shí)間的B組，差異有顯著性意義；雖然缺血14d和28d時(shí)C、D組缺血周邊區(qū)微血管計(jì)數(shù)均多于B組，但差別無顯著性意義。 結(jié)論：TMS、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可促進(jìn)大鼠腦梗死后缺血周邊區(qū)VEGF的表達(dá)上調(diào)，二者聯(lián)合作用更為明顯；大鼠腦梗死后缺血周邊區(qū)有代償性毛細(xì)血管新生，TMS+運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可促進(jìn)這種代償性微血管新生。 第四部分 經(jīng)顱磁刺激、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對腦梗死大鼠健側(cè)感覺運(yùn)動(dòng)皮層錐體細(xì)胞樹

16、突和突觸結(jié)構(gòu)的影響 目的：研究經(jīng)顱磁刺激(TMS)和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對腦梗死后大鼠健側(cè)感覺運(yùn)動(dòng)皮層錐體細(xì)胞樹突和突觸結(jié)構(gòu)的影響。 方法：選擇成年健康雄性SD大鼠制造大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型(MCAO)，將造模成功、符合入選條件并存活的32只大鼠再隨機(jī)分為自然恢復(fù)組(A組)、TMS組(B組)、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(C組)和TMS+運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(D組)，每組各8只，TMS組在MCAO后24h給予TMS治療，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組在MCAO后24h給予運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練

17、，TMS+運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組在MCAO后24h給予TMS+運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練；自然恢復(fù)組常規(guī)飼養(yǎng)；各組于治療后4w取材。 結(jié)果：與A組相比，治療4w后各組突觸界面曲率增加，突觸后致密物(PSD)厚度增加、突觸間隙變窄，差異具有非常顯著性意義(P＜0.05或0.01)；與A組相比，C組和D組穿孔突觸比例增加；而D組突觸間隙明顯窄于B組和C組。經(jīng)過4wTMS、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后動(dòng)物健側(cè)感覺運(yùn)動(dòng)皮層區(qū)錐體細(xì)胞樹突總長度、一級(jí)數(shù)突分支和單位長度樹突的樹突棘密度較

18、自然恢復(fù)組明顯增加(P＜0.05或0.01)；其中D組樹突總長度、一級(jí)數(shù)突分支和單位長度樹突的樹突棘密度明顯高于B、C組，差異有顯著性意義(P＜0.05或0.01)。 結(jié)論：TMS和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練治療可以改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能，并導(dǎo)致健側(cè)樹突和突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)的改變，使未受損側(cè)感覺運(yùn)動(dòng)皮層錐體細(xì)胞樹突總長度、分枝數(shù)和樹突棘突密度增加，突觸界面曲率增大、PSD厚度增加，突觸間隙變窄而使健側(cè)突觸傳遞功能增強(qiáng)，表明了TMS和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練促使健側(cè)腦