SCF、FL協(xié)同TPO對人臍血單個(gè)核細(xì)胞體外擴(kuò)增及造血重建功能的影響.pdf

1、臍血作為一種造血干細(xì)胞來源已被越來越多的應(yīng)用于臨床造血干細(xì)胞的移植，其移植后GVHD的發(fā)生率，病毒感染較骨髓、動員外周血低，但由于單份臍血細(xì)胞數(shù)量不足及移植后植入較慢限制了其臨床應(yīng)用。細(xì)胞因子介導(dǎo)的臍血造血細(xì)胞體外擴(kuò)增有望能解決這一問題，但何種細(xì)胞因子介導(dǎo)的體外擴(kuò)增不僅能使造血細(xì)胞數(shù)量增加，而且能夠上調(diào)和歸巢有關(guān)的黏附分子和CXCR4的表達(dá)，增加臍血造血細(xì)胞的植入能力尚未確定。因此，探討臍血造血細(xì)胞體外擴(kuò)增合適的細(xì)胞因子組合及其擴(kuò)增后的

2、造血細(xì)胞能否順利植入受體至關(guān)重要。本研究通過比較不同細(xì)胞因子組合對臍血造血細(xì)胞的擴(kuò)增效率及擴(kuò)增后造血細(xì)胞的植入水平，探討SCF、FL、TPO三因子組合作為臍血造血細(xì)胞體外擴(kuò)增的最佳細(xì)胞因子組合及其對造血重建功能的影響。 材料和方法1.材料：以臍血單個(gè)核細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)研究對象，臍血由廣州醫(yī)學(xué)院附屬廣州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科提供。 2.方法：(1)臍血MNCs體外擴(kuò)增：將臍血經(jīng)羥乙基淀粉(HES)沉淀，淋巴細(xì)胞分離液(Ficol

3、l-Hypapue)離心去除黏附細(xì)胞，所得單個(gè)核細(xì)胞按1×106/ml接種于含有不同細(xì)胞因子組合的終體積為6ml的50ml培養(yǎng)瓶中懸浮培養(yǎng)7或14天，在0天、7天和/或10、14天檢測有核細(xì)胞數(shù)，集落形成實(shí)驗(yàn)(CFU)數(shù)及用流式細(xì)胞儀檢測CD34+細(xì)胞數(shù)，同時(shí)檢測CD34+細(xì)胞上CXCR4+及CD49d+的表達(dá)。根據(jù)不同細(xì)胞因子組合實(shí)驗(yàn)分組為：①：對照組；②：SCF/FL(簡稱SF)組；③：SCF/FL/TPO(簡稱SFT)組；④：SC

4、F/FL/TPO/IL-6(簡稱SFT6)組。SCF、FL、IL-6終濃度為50ng/ml，TPO終濃度為20ng/ml。 (2).NOD/SCID小鼠臍血移植：NOD/SCID小鼠由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供，6～8周齡。移植前250cGyX線加速器亞致死量照射(劑量率220cGy/min)，照射后4小時(shí)經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)分組：(1)：新鮮臍血移植組(陽性對照組)：每只NOD/SCID小鼠經(jīng)尾靜脈輸注新鮮臍血200ul

5、含MNCs6×106個(gè)；(2)：擴(kuò)增臍血移植組(實(shí)驗(yàn)組)：每只NOD/SCID小鼠經(jīng)尾靜脈輸注與新鮮臍血組相同細(xì)胞數(shù)的經(jīng)SCF+FL+TPO3因子組合懸浮培養(yǎng)擴(kuò)增7天的臍血200ul；(3)：生理鹽水移植組(陰性對照組)：每只NOD/SCID小鼠輸注200ul生理鹽水。每組4只，重復(fù)4次。移植后飼養(yǎng)于無特定病原體條件下。6周后處死存活小鼠，收集骨髓細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測人CD34+、CD45+、CD19+、CD33+、CD3+細(xì)胞的比例

6、，PCR法檢測存活小鼠體內(nèi)的人特異的ALU序列。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，擴(kuò)增比較時(shí)采用方差分析，動物實(shí)驗(yàn)階段采用卡方檢驗(yàn)，student’t檢驗(yàn)和四格表的確切概率法。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.和對照組相比，SF組合僅能支持低水平的臍血造血細(xì)胞擴(kuò)增，加入TPO后即SCF/FL/TPO組合能有效的擴(kuò)增臍血細(xì)胞，但SFT和SFT6兩組之間卻無明顯區(qū)別(p＞0.05)。 2.SF、SF

7、T、SFT6三組細(xì)胞因子組合均可提高臍血CD34+細(xì)胞上CD49d，CXCR4的表達(dá)，但三組之間差異無顯著性(p＞0.05)。 3.SFT組臍血造血細(xì)胞經(jīng)過14天的培養(yǎng)，CD34+細(xì)胞數(shù)，CD34+CD49d+的細(xì)胞數(shù)于第7天達(dá)高峰，其后開始下降，而CFU數(shù)，CD34+CXCR4+細(xì)胞數(shù)則第10天達(dá)高峰，其后開始下降。 4.移植6周后，存活小鼠體內(nèi)均可檢測到人源性CD45+細(xì)胞，擴(kuò)增臍血移植組的NOD/SCID小鼠的存活