大鼠低氧誘導(dǎo)因子-1α基因載體的構(gòu)建及對骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)的實驗研究.pdf

1、脊髓缺血損傷(SpinalCordIschemiaInjury，SCII)是由各種原因引起的脊髓外傷、脊髓壓迫、胸腹主動脈外科手術(shù)中動脈的阻斷、損傷或低灌注壓造成的原發(fā)性損害。再灌注過程中可進一步加重神經(jīng)元損害，引起再灌注損傷。再灌注損傷是在缺血性損傷的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，涉及多種發(fā)病機制并影響缺血性疾病的預(yù)后，再灌注可以使可逆性缺血損傷加重，亦可能促進可逆性缺血損傷轉(zhuǎn)化為不可逆性損傷。探索脊髓缺血再灌注損傷的機制，并結(jié)合其發(fā)生機制制定切

2、實有效的治療方案，做到既能保證盡早恢復(fù)缺血組織的血流，又減輕或防止再灌注損傷的發(fā)生，是脊髓缺血性損傷防治中亟待解決的重要課題。很多研究證實有多種因素參與和調(diào)節(jié)SCII，但它們的具體作用以及作用途徑目前尚未明了。良好的血液循環(huán)是組織細胞獲得充足的氧和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)并排除代謝產(chǎn)物的基本保證，各種原因造成的組織血液灌注減少可使細胞發(fā)生缺血性損傷，盡早恢復(fù)組織的血液灌注是減輕缺血性損傷的根本措施。
　　轉(zhuǎn)基因技術(shù)和細胞移植是近年來興起的治療

3、技術(shù)，因此我們選擇轉(zhuǎn)基因技術(shù)與細胞移植技術(shù)結(jié)合的方法對脊髓缺血損傷進行探索性的治療。進行轉(zhuǎn)基因治療合適目的基因和載體的選擇非常重要。缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxiainduciblefactor1，HIF-1）是在1992年Semenza等[1]研究缺氧誘導(dǎo)的促紅細胞生成素基因表達時發(fā)現(xiàn)的一種核轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下廣泛存在于人類和哺乳動物細胞內(nèi)，它與增強脊髓組織細胞的耐受低氧能力,促進脊髓新生血管的形成[2，3]密切相關(guān)。骨髓基質(zhì)細胞

4、(BMSC)在一定的條件下可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞、心肌細胞、成骨細胞、脂肪細胞和肌母細胞[4]等，成為目前醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域最有潛力的研究工具。在體移植和離體實驗均證實，MSC可橫向分化為神經(jīng)細胞或神經(jīng)膠質(zhì)細胞，對治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病潛在的應(yīng)用前景[5]。因此我們利用缺氧誘導(dǎo)因子-1作為治療的目的基因并為其構(gòu)建合適的表達載體，選擇骨髓基質(zhì)細胞作為靶細胞，并且在進一步的研究中將構(gòu)建的HIF-1載體轉(zhuǎn)染到BMSC中。
　　實驗一：大鼠缺氧

5、誘導(dǎo)因子-1α基因表達載體的構(gòu)建
　　目的：構(gòu)建大鼠低氧誘導(dǎo)因子-1α的基因表達載體
　　方法：首先制備大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型，分離脊髓組織并提取HIF-1α總mRNA,利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)合成大鼠HIF-1α的cDNA；根據(jù)大鼠HIF-1α基因序列設(shè)計引物和酶切位點，并進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物純化后連接T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)進行基因克隆，雙酶切驗證后克隆入pcDNA3.1,雙酶切及測序驗證結(jié)果。
　　結(jié)果：提取

6、的mRNA完整，純度較高，OD=1.92；通過PCR擴增出2472bp的基因片段，與大鼠HIF-1α基因長度相符；雙酶切克隆載體可以得到2472bp目的片段，測序驗證無堿基的改變。
　　結(jié)論：大鼠HIF-1α與pcDNA3.1連接正確；成功構(gòu)建了大鼠HIF-1α基因的表達載體。
　　實驗二：大鼠骨髓基質(zhì)細胞的培養(yǎng)
　　目的：培養(yǎng)并獲得高純度的骨髓基質(zhì)細胞。
　　方法：用淋巴細胞液分離法獲取大鼠骨髓基質(zhì)細胞，于培養(yǎng)

7、瓶中進行原代培養(yǎng)，融合達90％時進行傳代培養(yǎng)，并傳至第三代；培養(yǎng)期間利用倒置顯微鏡觀察骨髓基質(zhì)細胞的生長特性；利用免疫細胞化學(xué)法檢測細胞表面抗原CD45和CD90的表達。
　　結(jié)果：倒置顯微鏡觀察到骨髓基質(zhì)細胞呈貼壁生長，為類成纖維細胞樣，大而扁平，原代細胞形狀差別較大，第三代趨于穩(wěn)定，以梭形為主；免疫細胞化學(xué)法鑒定CD45呈陰性表達為3.63％，CD90表達較高為96.2％。結(jié)論：大鼠骨髓基質(zhì)細胞體外培養(yǎng)生長良好；獲得的第三代細