維甲酸和刺猬因子促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)共分為兩部分研究維甲酸(RA)和刺猬因子(Shh)單獨(dú)和聯(lián)合誘導(dǎo)對(duì)促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(MN)發(fā)育的作用。第一部分使用本實(shí)驗(yàn)室制神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基(專利號(hào)：ZL02134314.4)培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)，掌握BMSCs的原代培養(yǎng)和純化方法，觀察細(xì)胞生長、發(fā)育和分化情況，并通過檢測神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記Nestin和MN發(fā)育過程重要標(biāo)記蛋白Hb9，研究了BMSCs的增殖、分化生物學(xué)特點(diǎn)。第二部分研究依誘導(dǎo)劑不同

2、分四組(空白組、RA組、Shh組和RA+Shh組)誘導(dǎo)BMSCs，觀察骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞(BMSCs-D-NSCs)的生長增殖及分化情況，檢測Nestin和Hb9標(biāo)記表達(dá)，并結(jié)合發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)的知識(shí)探討B(tài)MSCs-D-NSCs進(jìn)一步分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的潛力。 第一章小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及生物學(xué)特性觀察 目的 研究BMSCs取材、原代培養(yǎng)方法，觀察細(xì)胞在特制培養(yǎng)基的生長、增殖和形態(tài)變化狀況，掌握BMSCs-D-NS

3、Cs體外培養(yǎng)要點(diǎn)和生長生物學(xué)特性，獲得穩(wěn)定純化的BMSCs-D-NSCs，為后續(xù)誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法 1、小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)：麻醉5～7周新西蘭小鼠，使用注射器以5ml培養(yǎng)基無菌沖洗出股骨和脛骨骨髓細(xì)胞，以Ficoll-Paque液(相對(duì)密度1.077)梯度密度離心法獲取有核細(xì)胞層接種。使用本實(shí)驗(yàn)室制神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液(專利號(hào)：ZL02134314.4)培養(yǎng)，加入10％胎牛血清，首次24h后換液，以后每三天

4、換液； 2、小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)6天后0.125％胰酶消化使貼壁細(xì)胞脫落，收集細(xì)胞懸液離心后接種傳代； 3、相差顯微鏡下觀察原代及傳代細(xì)胞生長狀況； 4、Nestin和Hb9免疫細(xì)胞化學(xué)檢測：在傳代培養(yǎng)后第8、12、16、20天，以Nestin(1∶200，神經(jīng)干細(xì)胞相對(duì)特異性標(biāo)記抗體)和Hb9(1∶500，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性標(biāo)記抗體)為檢測指標(biāo)，依改良SABC法和間接免疫熒光法對(duì)傳代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)

5、胞化學(xué)檢測。 結(jié)果 1、BMSCs初接種在培養(yǎng)孔中呈散在圓形細(xì)胞，接種24h后，可見大部分細(xì)胞已貼壁，48～72h后細(xì)胞貼壁緊密，細(xì)胞整體體積明顯增大，部分細(xì)胞向梭型和多角型發(fā)展，胞漿豐富。培養(yǎng)第6天進(jìn)行細(xì)胞傳代，此時(shí)貼壁細(xì)胞被胰酶消化后重新呈散在圓形細(xì)胞，部分成團(tuán)，胞體直徑比接種初大約1～2倍。傳代接種后的細(xì)胞立體感增強(qiáng)，并可見胞體收縮成錐形或球形；在傳代后，部分細(xì)胞伸出較細(xì)長突起，但仍有部分細(xì)胞呈圓形。在培養(yǎng)后期(第

6、20天)，細(xì)胞由以圓形為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐酝黄鸺?xì)胞為主。 2、Nestin檢測到少量細(xì)胞陽性，陽性率＜4％，Hb9熒光表達(dá)陰性。 結(jié)論 密度離心法結(jié)合貼壁法可獲得形態(tài)較為純一的BMSCs，細(xì)胞生長穩(wěn)定，增殖分化能力良好。在所檢測時(shí)間點(diǎn)上，Nestin陽性細(xì)胞＜4％，推斷沒有或只有極少數(shù)BMSCs-D-NSCs生成。雖有細(xì)胞分化、但尚未發(fā)現(xiàn)Hb9陽性表達(dá)細(xì)胞，提示生成的多突起細(xì)胞不具有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的特性。 第二章RA

7、和Shh促進(jìn)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育的實(shí)驗(yàn)研究 目的 研究維甲酸(RA)和刺猬因子(Shh)單獨(dú)和聯(lián)合作用對(duì)促進(jìn)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(MN)發(fā)育的作用。 方法 1、BMSCs的原代培養(yǎng)：麻醉5～7周新西蘭小鼠，無菌沖洗出股骨和脛骨骨髓細(xì)胞，使用Ficoll-Paque液(相對(duì)密度1.077)分離取有核細(xì)胞層接種。使用本實(shí)驗(yàn)室自制神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液(專利號(hào)：ZL02134314.

8、4)培養(yǎng)，加入10％胎牛血清，依實(shí)驗(yàn)分組分別加入不同誘導(dǎo)劑：①空白對(duì)照組；②RA組：加入0.5ug/mlRA；③Shh組：加入200ng/mlShh因子；④RA+Shh組：加入0.5ug/mlRA和200ng/mlShh。在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，24h后首次換液，以后每3天換液； 2、BMSCs的傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)6天后0.125％胰酶消化使貼壁細(xì)胞脫落，吹打收集細(xì)胞懸液離心后接種傳代； 3、相差顯微鏡下觀

9、察原代及傳代細(xì)胞生長狀況； 4、Nestin和Hb9免疫細(xì)胞化學(xué)檢測：在培養(yǎng)后第8、12、16、20天，以Nestin(1∶200，神經(jīng)干細(xì)胞相對(duì)特異性標(biāo)記抗體)和Hb9(1∶500，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性標(biāo)記抗體)為檢測指標(biāo)，依改良SABC法和間接免疫熒光法對(duì)傳代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。 5、倒置顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。每組選取6個(gè)細(xì)胞密度適中的視野，計(jì)算Nestin陽性(或Hb9陽性)細(xì)胞數(shù)N1和一個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞

10、總數(shù)N2，計(jì)算各陽性細(xì)胞占視野總細(xì)胞百分比R=N1/N2×100％，采用42析因設(shè)計(jì)分析四個(gè)實(shí)驗(yàn)分組在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差別。控制單效應(yīng)下采用One—WayANOVA對(duì)比組間數(shù)據(jù)，兩兩比較使用秩和檢驗(yàn)法，顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。 結(jié)果vRA組Nestin陽性表達(dá)率比其他三組都高(P=0.000)，最高表達(dá)可達(dá)80％。Shh組和對(duì)照組的Nestin表達(dá)陽性率均很低(＜4％)，兩者間無顯著差別(P=0.885)；RA+Shh組的Nest

11、in陽性細(xì)胞百分比最高不大于40％，和對(duì)照組比較有差別(P=0.000)。四組中只有RA+Shh組Hb9表達(dá)陽性，其他組均未檢測到Hb9抗體。 結(jié)論 1、RA可促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞Nestin陽性表達(dá)；單獨(dú)使用Shh沒有明顯促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化； 2、在RA誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，使用Shh可以誘導(dǎo)骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在發(fā)育過程中的重要蛋白Hb9，