葉酸預防維甲酸腭裂模型的研究.pdf

1、腭裂是人類常見的先天性畸形之一，其發(fā)病原因較為復雜，目前多傾向于由遺傳與環(huán)境因素的共同作用所致，且與多個基因有關，是一種多基因遺傳病。其發(fā)病機制可能與細胞的增殖與凋亡，多種細胞因子及其受體表達的改變等有關。但腭部發(fā)育及腭裂形成過程中相關基因的確切作用和其表達的變化尚不明確。因此，研究腭裂的發(fā)病機理及探尋有效的防治措施顯得尤為重要。 全反式維甲酸（all trans retinoic acid，ATRA）是維生素A的代謝物，生理水

2、平的維甲酸能夠調控細胞的增殖和分化，與正常的生長發(fā)育密切相關；而過量的維甲酸有明顯的毒副作用，可以誘導多種生物的組織器官形成畸形。ATRA誘導腭裂形成的原因可能與調控腭間充質細胞凋亡，干擾上皮一間充質轉化及中嵴上皮的消退等有關，但其確切的作用機制仍有待研究。 葉酸（folic acid，F(xiàn)A）是一種水溶性B族維生素，由喋啶核、對氨苯甲酸及谷氨酸三部分組成，在細胞生長、分化、修復和宿主防御等方面扮演重要角色，是DNA和RNA合成過

3、程中需要的重要物質。葉酸缺乏影響細胞的正常代謝，導致包括腭裂在內(nèi)的多種先天性畸形發(fā)生。作為一種預防腭裂的有效藥物，葉酸在臨床上已經(jīng)被廣泛應用，但其作用機理仍不明確。 本研究建立維甲酸誘導腭裂模型，應用腭器官體外培養(yǎng)法，模擬腭板的生長及融合過程，并檢測維甲酸受體的時空表達變化，闡明ATRA誘導腭裂的分子機制。葉酸是一種腭裂預防的常用藥物，研究其預防ATRA誘導腭裂的作用機制，可為減少腭裂的發(fā)生提供有益的參考。 目的：

4、 1．建立維甲酸腭裂模型，應用腭器官體外培養(yǎng)法，觀察不同條件下腭板的生長及融合情況。 2．檢測維甲酸受體RARα、RARβ及RXRα在胚胎腭中的時空表達變化，闡明ATRA誘導腭裂的分子機制。 3．研究葉酸預防ATRA誘導腭裂的作用機制，為腭裂預防提供有益的參考。 研究方法： 1．腭器官體外培養(yǎng)模型選取10周齡左右SPF級C57BL/6J近交系小鼠，于第一天晚8時按雌雄比1∶1合籠交配，第二天上午8時檢測

5、陰栓，將陰栓陽性的雌鼠記為妊娠0天（gestation0 day，GD0）。孕鼠于GD14處死，將胎鼠從母鼠子宮內(nèi)取出，在無菌條件下解剖出胎鼠的雙側腭板，放入盛有DMEM/F12培養(yǎng)基的器官培養(yǎng)皿中。將ATRA溶于無水乙醇，葉酸溶于NaOH，隨DMEM/F12培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿中，使ATRA終濃度分別為1μM、10μM，葉酸的終濃度為0．1mM。實驗分6組，即對照組、ATRA1μM組、ATRA10μM組、Folic acid組、ATRA1

6、0μM+FA（0h）組、ATRA10μM+FA（24h）組，每組有8個樣本。將培養(yǎng)皿置于含5％CO2、37℃恒溫箱中，分別培養(yǎng)24小時、48小時及72小時后取出腭板，吖啶橙染色，鏡下觀察各組腭板在不同時間點的組織學形態(tài)。然后將腭板用福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片，HE染色后觀察。 2．維甲酸誘導腭裂的機理及葉酸的預防作用研究免疫組化染色法檢測各組腭板中維甲酸受體RARα、RARpβ及RXRα的時空表達變化，從而推斷出維甲酸誘導

7、腭裂的機理及葉酸預防腭裂可能的原因。 結果： 1．本實驗成功地建立維甲酸誘導腭裂模型，運用腭器官體外培養(yǎng)法，觀察不同條件下腭板的組織學形態(tài)?？梢娕囵B(yǎng)24小時、48小時和72小時后，對照組腭板的融合數(shù)分別為4、7、8，而1μM及10μM ATRA組未見腭板融合，差異有顯著性（P<0．05），說明過量的ATRA具有明顯的致畸性，能夠誘導腭裂形成。ATRA10μM+FA（0h）組各個時間點腭板的融合數(shù)為4、5、6，與對照組和葉

8、酸組相近，而與ATRA組差異明顯（P<0．05），表明葉酸能夠預防ATRA誘導的腭裂。ATRA10μM+FA（24h）組培養(yǎng)48小時后腭板的融合數(shù)僅為1，與對照組差異顯著（P<0．05），提示葉酸盡管可以有效預防ATRA誘導的腭裂，但卻沒有治療的功效。 2．應用免疫組化法檢測維甲酸受體的變化發(fā)現(xiàn)：RARα、RARβ及RXRα在胚鼠腭中呈胞核表達，其表達的變化隨腭部的發(fā)育階段和腭突的不同部位而有差異。ATRA誘導RARα的表達作用

9、不明顯，隨ATRA濃度的升高，RARα的表達略有增強，主要見于腭間充質細胞。ATRA可明顯上調RARβ的表達，且與部位、時間及ATRA濃度有關。ATRA濃度越高，誘導RARβ表達的作用越強，且多見于腭板融合期的間充質和口腔側上皮。ATRA在腭板融合期可以明顯地抑制RXRα在間充質中的表達，并稍增強其在上皮中表達。早期加入葉酸可以拮抗ATRA的作用，使維甲酸受體RARα、RARβ及RXRα在腭部的表達情況接近于對照組。但如果在ATRA作用

10、24小時后再加入葉酸，則無這種效果，可見其維甲酸受體表達情況與對照組差異明顯，而與ATRA組基本相同。 結論： 1．本研究成功建立維甲酸誘導腭裂模型。通過腭板器官體外培養(yǎng)法，基本可以重復體內(nèi)雙側腭突接觸融合過程。并通過向腭板培養(yǎng)基中加入不同濃度ATRA，建立維甲酸誘導腭裂模型，為研究腭裂的發(fā)病機理提供了可靠的手段。 2．成功運用葉酸預防ATRA誘導的腭裂。運用葉酸時需注意時間和劑量，只有早期應用適量的葉酸，才能有