耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)及冷激蛋白Csp介導(dǎo)的冷脅迫調(diào)控機(jī)制.pdf

1、低溫是細(xì)菌生存面臨的一種主要環(huán)境脅迫因素。細(xì)菌急性暴露于低溫環(huán)境時(shí)，為應(yīng)對(duì)這種變化細(xì)胞將產(chǎn)生一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即冷激反應(yīng)。在冷激反應(yīng)中會(huì)大量誘導(dǎo)合成一類(lèi)小分子蛋白質(zhì)家族統(tǒng)稱為冷激蛋白(cold shock proteins，Csps)。大量的實(shí)驗(yàn)表明，冷激蛋白在適應(yīng)低溫脅迫和正常生長(zhǎng)過(guò)程中都起到重要作用。耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）能生存于多種極端環(huán)境，但其冷脅迫的應(yīng)答反應(yīng)尚不清楚，特別是冷激蛋白Cs

2、p介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制報(bào)道甚少。本研究以耐輻射異常球菌作為研究對(duì)象，利用RNA-Seq技術(shù)測(cè)定正常和冷激條件下野生型菌株和csp突變株的轉(zhuǎn)錄組，并進(jìn)一步用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，測(cè)定其相關(guān)生理生化表型，探討了Csp的作用機(jī)制，取得如下結(jié)果:
　　1.Western Blot結(jié)果顯示，Csp在冷激4h后開(kāi)始大量積累，具備冷激反應(yīng)的基本特征。為了揭示耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)的過(guò)程，開(kāi)展了該菌在正常條件和冷脅迫條件下(15℃，4h)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)定，

3、分析結(jié)果表明，冷脅迫導(dǎo)致199個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，642個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，其中包括了低溫信號(hào)感應(yīng)，傳遞和應(yīng)答的過(guò)程所涉及的代謝通路。其冷激反應(yīng)的基本特征如下:1）DNA旋轉(zhuǎn)酶基因gryB上調(diào)了2.1倍，UvrABC途徑相關(guān)基因均上調(diào)1.8倍以上，有效防止低溫對(duì)細(xì)胞核酸結(jié)構(gòu)的破壞;2）過(guò)氧化氫酶基因katA上調(diào)了16倍，防止低溫產(chǎn)生的氧自由基對(duì)蛋白造成的損傷;3）細(xì)胞膜S層結(jié)構(gòu)基因均上調(diào)2倍以上，幫助維持低溫下細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。根據(jù)以上結(jié)果，繪制了

4、耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)調(diào)節(jié)圖。研究表明，大腸桿菌冷激反應(yīng)增強(qiáng)DNA修復(fù)及滲透保護(hù)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，耐輻射異常球菌除這些特征外，還在抗氧化和細(xì)胞膜保護(hù)等方面進(jìn)行了應(yīng)答。
　　2.序列分析表明，耐輻射異常球菌基因組中只含有1個(gè)冷激蛋白同源的基因，被命名為csp。同源比對(duì)和三維建模證明，Csp具有冷激蛋白家族典型的核酸結(jié)合域，可能對(duì)其他代謝途徑進(jìn)行調(diào)控。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，csp冷激前后均處于高表達(dá)狀態(tài)，為了研究csp在該菌中的功能，我們構(gòu)建

5、了csp基因的突變株△csp和回補(bǔ)株△cspC，發(fā)現(xiàn)在15℃C冷脅迫下突變株△csp生長(zhǎng)停止，野生型和回補(bǔ)株△cspC可以緩慢生長(zhǎng)。正常溫度下表型分析發(fā)現(xiàn):1）突變株△csp生長(zhǎng)慢于野生型和回補(bǔ)株△cspC，可見(jiàn)csp的缺失影響細(xì)胞的生長(zhǎng)速度;2）△csp對(duì)過(guò)氧化氫敏感。上述研究表明，Csp在耐輻射異常球菌低溫生存中發(fā)揮重要作用，同時(shí)還參與正常條件下多個(gè)代謝途徑的調(diào)控。
　　3.為進(jìn)一步探究Csp的調(diào)節(jié)機(jī)制，開(kāi)展了冷脅迫下野生型和

6、突變株△csp的轉(zhuǎn)錄組研究，結(jié)合相關(guān)基因的啟動(dòng)子分析:促旋酶基因（gyrB），過(guò)氧化氫酶基因（katA）和麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因(malE)的啟動(dòng)子區(qū)都含有Csp偏好結(jié)合的序列，推測(cè)Csp可能通過(guò)結(jié)合這些基因的啟動(dòng)子對(duì)它們進(jìn)行調(diào)控。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，在低溫下katA和katE基因表達(dá)量分別提高了2.2倍和3倍。低溫下過(guò)氧化氫酶活性為正常條件的1.6倍，而在△csp中卻受到抑制。推測(cè)低溫誘導(dǎo)的冷激蛋白Csp可以提高過(guò)氧化氫酶活性，有效的清除