基于冷通道蛋白TRPM8及TRPA1探討當(dāng)歸對(duì)低溫誘導(dǎo)的異常疼痛及血管反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、本課題基于冷通道蛋白 TRPM8及 TRPA1，探討了當(dāng)歸對(duì)低溫誘導(dǎo)的異常疼痛及血管反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。當(dāng)歸四逆湯是治療血虛寒凝證的主方，以疼痛及周圍循環(huán)障礙為主要特征。當(dāng)歸是該方的君藥，故本實(shí)驗(yàn)分為在體研究及離體細(xì)胞兩部分，前者研究對(duì)象為當(dāng)歸，后者研究對(duì)象為當(dāng)歸的主要成分阿魏酸及 Z-藁本內(nèi)酯。
　　1.當(dāng)歸對(duì)大鼠奧沙利鉑周圍神經(jīng)毒性模型及其局部低溫異常血管反應(yīng)的修復(fù)作用
　　目的：以TRPM8及TRPA1蛋白為切入點(diǎn)，探討急

2、性及慢性奧沙利鉑周圍神經(jīng)毒性模型中疼痛與低溫誘導(dǎo)的局部表皮異常血管反應(yīng)中的相關(guān)性。由于當(dāng)歸具有擬雌激素樣作用，奧沙利鉑周圍神經(jīng)毒性在不同性別人群中具有不同的臨床特征，因此，在此基礎(chǔ)上探討當(dāng)歸及雌二醇的治療作用及機(jī)制。
　　方法：將雌性SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（急性及慢性各1組）、奧沙利鉑急性周圍神經(jīng)毒性模型組（第1、2天腹腔注射奧沙利鉑6mg/kg）、奧沙利鉑慢性周圍神經(jīng)毒性模型組（第1、2、7、8、14、15天腹腔注射奧沙利鉑

3、溶液6mg/kg）、雌二醇治療組（模型組基礎(chǔ)上，急性組于第1、2、3天，慢性組于第1、2、4、7、8、10、14、15、17天予以背部皮下注射17β-雌二醇200ug/100g）、當(dāng)歸治療組（模型組基礎(chǔ)上，急性組于1、2、3天，1、2、4、7、8、10、14、15、17天灌胃當(dāng)歸顆粒劑溶液0.2mg/100g）、氟維司群（雌激素受體拮抗劑）+當(dāng)歸治療組（慢性當(dāng)歸治療組基礎(chǔ)上，第1、2、4、7、8、10、14、15、17天灌胃當(dāng)歸前予以皮

4、下注射氟維司群溶液0.5mg/100g）。在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行疼痛行為學(xué)測(cè)試；取材當(dāng)天戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，同側(cè)足部預(yù)先予以皮下注射 TRPA1拮抗劑HC030031或TRPM8拮抗劑 AMTB，對(duì)側(cè)足部予以生理鹽水皮下注射作為對(duì)照組，采用激光多普勒血流儀測(cè)量大鼠足底某固定位置的基線血流，及2分鐘冷水刺激后20分鐘以內(nèi)的血流變化；血流測(cè)量結(jié)束后，取足部皮膚進(jìn)行CGRP、NO代謝物及去甲腎上腺素含量測(cè)定；取大鼠背根神經(jīng)節(jié)，Western bl

5、ot檢測(cè)TRPM8及TRPA1蛋白含量，免疫熒光測(cè)量CGRP含量；取大鼠坐骨神經(jīng)，予以HE染色及LFB髓鞘染色判斷坐骨神經(jīng)損傷情況。
　　結(jié)果：奧沙利鉑急性及慢性周圍神經(jīng)毒性模型均表現(xiàn)出明顯的冷敏感、冷痛覺及機(jī)械性痛覺，當(dāng)歸對(duì)急性模型的冷痛覺及冷過敏有緩解作用，雌二醇對(duì)急性模型的機(jī)械痛覺有緩解作用，兩者均可顯著抑制慢性模型的冷痛覺、冷過敏及機(jī)械痛覺，阻斷雌激素受體可明顯抑制當(dāng)歸的緩解作用。急性模型背根神經(jīng)節(jié)中的TRPM8及TRPA

6、1蛋白含量明顯增加，當(dāng)歸可顯著抑制TRPA1含量增加；慢性模型TRPA1蛋白含量明顯增加，雌二醇及當(dāng)歸均可顯著減少TRPA1的增加，阻斷雌激素受體可明顯抑制當(dāng)歸的作用。急性模型背根神經(jīng)節(jié)CGRP陽性細(xì)胞比例增加，雌二醇及當(dāng)歸均可顯著抑制CGRP陽性細(xì)胞比例；慢性模型中，CGRP陽性細(xì)胞比例增加，雌二醇及當(dāng)歸對(duì)此有部分抑制作用，阻斷雌激素受體不能減少當(dāng)歸的抑制作用。急性模型，坐骨神經(jīng)沒有明顯的形態(tài)學(xué)改變，雌二醇及當(dāng)歸對(duì)其也沒有明顯影響；慢

7、性模型，坐骨神經(jīng)出現(xiàn)有髓鞘神經(jīng)纖維數(shù)量減少，及明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，雌二醇及當(dāng)歸對(duì)坐骨神經(jīng)損傷具有一定修復(fù)作用，阻斷雌激素受體可明顯抑制當(dāng)歸的修復(fù)作用。正常對(duì)照組低溫刺激后出現(xiàn)單向收縮血流變化，且HC030031或AMTB可明顯抑制收縮。急性及慢性模型組，低溫刺激后出現(xiàn)雙向先舒張后收縮血流變化，HC030031可明顯抑制舒張及其后的收縮；雌二醇治療組可減少舒張程度；當(dāng)歸治療組恢復(fù)為正常的單向收縮。正常對(duì)照組，低溫刺激后足部的CGRP及NO

8、代謝物水平?jīng)]有顯著變化；急性及慢性模型組基線CGRP水平及 NO代謝物水平?jīng)]有變化，急性及慢性模型組冷刺激后 CGRP明顯增加，予以HC030031可明顯抑制CGRP的增加，雌二醇對(duì)急性模型組的CGRP含量起到部分減少的作用，而對(duì)慢性模型組沒有影響，當(dāng)歸可明顯抑制CGRP增加，雌激素受體拮抗劑不影響當(dāng)歸的抑制作用；急性模型組基線冷刺激后NO代謝物水平?jīng)]有變化，慢性模型組冷刺激后NO代謝物水平明顯增加，HC030031或AMTB均不抑制其

9、增加，雌二醇對(duì)此沒有作用，當(dāng)歸可明顯抑制NO代謝物的增加，雌激素受體拮抗劑不影響當(dāng)歸的抑制作用。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)了奧沙利鉑周圍神經(jīng)毒性模型的低溫誘導(dǎo)后的異常血管舒張、雌二醇及當(dāng)歸通過雌激素受體對(duì)該疼痛模型的治療作用，以及當(dāng)歸對(duì)該模型異常血管反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)作用。急性及慢性奧沙利鉑模型均出現(xiàn)明顯的疼痛反應(yīng)及低溫刺激后異常血管舒張，疼痛可能與TRPM8、TRPA1、疼痛標(biāo)志物CGRP及坐骨神經(jīng)損傷有關(guān)，異常血管舒張可能與局部的TR

10、PM8/TRPA1通路、感覺神經(jīng)纖維CGRP的釋放及局部NOS/NO系統(tǒng)的異常調(diào)節(jié)有關(guān)。雌二醇及當(dāng)歸可通過上述部分機(jī)制緩解疼痛，并恢復(fù)局部皮膚血管對(duì)低溫刺激的正常反應(yīng)。
　　2. Z-藁本內(nèi)酯及阿魏酸對(duì)胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPM8/TRPA1功能及表達(dá)的協(xié)同調(diào)節(jié)作用
　　目的：探討TRPM8及TRPA1對(duì)胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮的“鈣依賴性途徑”及“鈣敏感性途徑”信號(hào)通路的作用，及低溫對(duì)TRPM8及TRPA1表達(dá)的影響。在此基

11、礎(chǔ)上探討Z-藁本內(nèi)酯及阿魏酸對(duì)其的作用，并根據(jù)Chou and Talay方法，計(jì)算兩藥聯(lián)用是否具有相加、協(xié)同或拮抗作用。
　　方法：采用Fluo-4鈣離子指示劑孵育HASMC，分別予以RyR抑制或IP3R抑制劑預(yù)孵育排除 CICR干擾后，予以 TRPM8激動(dòng)劑 WS-12或 TRPA1激動(dòng)劑 ASP7663刺激HASMC，記錄熒光變化率。檢測(cè)不同濃度的Z-藁本內(nèi)酯或阿魏酸對(duì)WS-12或ASP7663引起的最大熒光強(qiáng)度的抑制作用，

12、根據(jù)ED50確定聯(lián)合用藥的藥物濃度，使用軟件Calcusyn計(jì)算不同藥效下的合并指數(shù)。根據(jù)上述藥物濃度，采用GST pull-down及Western blot檢測(cè)Z-藁本內(nèi)酯、阿魏酸及混合藥物對(duì)WS-12或ASP7663引起的RhoA活性、p-MLC/t-MLC變化的影響。將HASMC放入10℃的全溫培養(yǎng)箱孵育4小時(shí)，采用qRT-PCR法檢測(cè)TRPM8及TRPA1 mRNA水平變化，檢測(cè)不同濃度的Z-藁本內(nèi)酯或阿魏酸對(duì)其的抑制作用，根

13、據(jù) ED50確定聯(lián)合用藥的藥物濃度，使用軟件Calcusyn計(jì)算不同藥效下的合并指數(shù)。
　　結(jié)果：WS-12及ASP7663均可引起HASMC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，前者與外鈣內(nèi)流及RyR受體內(nèi)鈣釋放有關(guān)，后者與外鈣內(nèi)流及RyR受體/IP3受體的內(nèi)鈣釋放有關(guān)。在排除CICR的影響后，阿魏酸及Z-藁本內(nèi)酯對(duì)WS-12或ASP7663引起的熒光變化成濃度依賴性的抑制作用，ED50值分別為（9.124±1.04μM）及（6.836±1.

14、13μM），根據(jù)ED50值確定混合藥物濃度梯度，合并指數(shù)CI＜1。ASP7663可引起HASMC RhoA活性及p-MLC/t-MLC增加，WS-12可引起p-MLC/t-MLC增加，阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯及混合藥物組均可顯著抑制ASP7663或WS-12引起的變化，與阿魏酸組或 Z-藁本內(nèi)酯組相比，混合藥物組對(duì) MLC磷酸化水平有更明顯的抑制作用。低溫（10℃，4小時(shí)）可顯著增加HASMC TRPM8 mRNA水平，阿魏酸及Z-藁本內(nèi)酯

15、均能顯著減少TRPM8 mRNA的增加，ED50分別為（3.416±1.05μM）及（2.325±1.06μM），根據(jù)ED50值確定混合藥物濃度梯度，合并指數(shù)CI＜1。
　　結(jié)論：TRPM8或TRPA1的激活均可引起胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的收縮，前者主要通過鈣依賴途徑引起細(xì)胞收縮，后者則可以同時(shí)激活鈣依賴性途徑及鈣敏感性途徑中的關(guān)鍵靶點(diǎn)RhoA激酶。低溫可顯著增加TRPM8 mRNA表達(dá)。阿魏酸及Z-藁本內(nèi)酯對(duì)上述作用靶點(diǎn)具有協(xié)同抑制