基于冷通道蛋白TRPM8及TRPA1探討當歸對低溫誘導的異常疼痛及血管反應的調控機制.pdf

1、本課題基于冷通道蛋白 TRPM8及 TRPA1，探討了當歸對低溫誘導的異常疼痛及血管反應的調控機制。當歸四逆湯是治療血虛寒凝證的主方，以疼痛及周圍循環(huán)障礙為主要特征。當歸是該方的君藥，故本實驗分為在體研究及離體細胞兩部分，前者研究對象為當歸，后者研究對象為當歸的主要成分阿魏酸及 Z-藁本內酯。
　　1.當歸對大鼠奧沙利鉑周圍神經毒性模型及其局部低溫異常血管反應的修復作用
　　目的：以TRPM8及TRPA1蛋白為切入點，探討急

2、性及慢性奧沙利鉑周圍神經毒性模型中疼痛與低溫誘導的局部表皮異常血管反應中的相關性。由于當歸具有擬雌激素樣作用，奧沙利鉑周圍神經毒性在不同性別人群中具有不同的臨床特征，因此，在此基礎上探討當歸及雌二醇的治療作用及機制。
　　方法：將雌性SD大鼠隨機分為空白對照組（急性及慢性各1組）、奧沙利鉑急性周圍神經毒性模型組（第1、2天腹腔注射奧沙利鉑6mg/kg）、奧沙利鉑慢性周圍神經毒性模型組（第1、2、7、8、14、15天腹腔注射奧沙利鉑

3、溶液6mg/kg）、雌二醇治療組（模型組基礎上，急性組于第1、2、3天，慢性組于第1、2、4、7、8、10、14、15、17天予以背部皮下注射17β-雌二醇200ug/100g）、當歸治療組（模型組基礎上，急性組于1、2、3天，1、2、4、7、8、10、14、15、17天灌胃當歸顆粒劑溶液0.2mg/100g）、氟維司群（雌激素受體拮抗劑）+當歸治療組（慢性當歸治療組基礎上，第1、2、4、7、8、10、14、15、17天灌胃當歸前予以皮

4、下注射氟維司群溶液0.5mg/100g）。在不同時間點進行疼痛行為學測試；取材當天戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，同側足部預先予以皮下注射 TRPA1拮抗劑HC030031或TRPM8拮抗劑 AMTB，對側足部予以生理鹽水皮下注射作為對照組，采用激光多普勒血流儀測量大鼠足底某固定位置的基線血流，及2分鐘冷水刺激后20分鐘以內的血流變化；血流測量結束后，取足部皮膚進行CGRP、NO代謝物及去甲腎上腺素含量測定；取大鼠背根神經節(jié)，Western bl

5、ot檢測TRPM8及TRPA1蛋白含量，免疫熒光測量CGRP含量；取大鼠坐骨神經，予以HE染色及LFB髓鞘染色判斷坐骨神經損傷情況。
　　結果：奧沙利鉑急性及慢性周圍神經毒性模型均表現出明顯的冷敏感、冷痛覺及機械性痛覺，當歸對急性模型的冷痛覺及冷過敏有緩解作用，雌二醇對急性模型的機械痛覺有緩解作用，兩者均可顯著抑制慢性模型的冷痛覺、冷過敏及機械痛覺，阻斷雌激素受體可明顯抑制當歸的緩解作用。急性模型背根神經節(jié)中的TRPM8及TRPA

6、1蛋白含量明顯增加，當歸可顯著抑制TRPA1含量增加；慢性模型TRPA1蛋白含量明顯增加，雌二醇及當歸均可顯著減少TRPA1的增加，阻斷雌激素受體可明顯抑制當歸的作用。急性模型背根神經節(jié)CGRP陽性細胞比例增加，雌二醇及當歸均可顯著抑制CGRP陽性細胞比例；慢性模型中，CGRP陽性細胞比例增加，雌二醇及當歸對此有部分抑制作用，阻斷雌激素受體不能減少當歸的抑制作用。急性模型，坐骨神經沒有明顯的形態(tài)學改變，雌二醇及當歸對其也沒有明顯影響；慢

7、性模型，坐骨神經出現有髓鞘神經纖維數量減少，及明顯的炎癥細胞浸潤，雌二醇及當歸對坐骨神經損傷具有一定修復作用，阻斷雌激素受體可明顯抑制當歸的修復作用。正常對照組低溫刺激后出現單向收縮血流變化，且HC030031或AMTB可明顯抑制收縮。急性及慢性模型組，低溫刺激后出現雙向先舒張后收縮血流變化，HC030031可明顯抑制舒張及其后的收縮；雌二醇治療組可減少舒張程度；當歸治療組恢復為正常的單向收縮。正常對照組，低溫刺激后足部的CGRP及NO

8、代謝物水平沒有顯著變化；急性及慢性模型組基線CGRP水平及 NO代謝物水平沒有變化，急性及慢性模型組冷刺激后 CGRP明顯增加，予以HC030031可明顯抑制CGRP的增加，雌二醇對急性模型組的CGRP含量起到部分減少的作用，而對慢性模型組沒有影響，當歸可明顯抑制CGRP增加，雌激素受體拮抗劑不影響當歸的抑制作用；急性模型組基線冷刺激后NO代謝物水平沒有變化，慢性模型組冷刺激后NO代謝物水平明顯增加，HC030031或AMTB均不抑制其

9、增加，雌二醇對此沒有作用，當歸可明顯抑制NO代謝物的增加，雌激素受體拮抗劑不影響當歸的抑制作用。
　　結論：本實驗首次發(fā)現了奧沙利鉑周圍神經毒性模型的低溫誘導后的異常血管舒張、雌二醇及當歸通過雌激素受體對該疼痛模型的治療作用，以及當歸對該模型異常血管反應的逆轉作用。急性及慢性奧沙利鉑模型均出現明顯的疼痛反應及低溫刺激后異常血管舒張，疼痛可能與TRPM8、TRPA1、疼痛標志物CGRP及坐骨神經損傷有關，異常血管舒張可能與局部的TR

10、PM8/TRPA1通路、感覺神經纖維CGRP的釋放及局部NOS/NO系統的異常調節(jié)有關。雌二醇及當歸可通過上述部分機制緩解疼痛，并恢復局部皮膚血管對低溫刺激的正常反應。
　　2. Z-藁本內酯及阿魏酸對胸主動脈平滑肌細胞TRPM8/TRPA1功能及表達的協同調節(jié)作用
　　目的：探討TRPM8及TRPA1對胸主動脈平滑肌細胞收縮的“鈣依賴性途徑”及“鈣敏感性途徑”信號通路的作用，及低溫對TRPM8及TRPA1表達的影響。在此基

11、礎上探討Z-藁本內酯及阿魏酸對其的作用，并根據Chou and Talay方法，計算兩藥聯用是否具有相加、協同或拮抗作用。
　　方法：采用Fluo-4鈣離子指示劑孵育HASMC，分別予以RyR抑制或IP3R抑制劑預孵育排除 CICR干擾后，予以 TRPM8激動劑 WS-12或 TRPA1激動劑 ASP7663刺激HASMC，記錄熒光變化率。檢測不同濃度的Z-藁本內酯或阿魏酸對WS-12或ASP7663引起的最大熒光強度的抑制作用，

12、根據ED50確定聯合用藥的藥物濃度，使用軟件Calcusyn計算不同藥效下的合并指數。根據上述藥物濃度，采用GST pull-down及Western blot檢測Z-藁本內酯、阿魏酸及混合藥物對WS-12或ASP7663引起的RhoA活性、p-MLC/t-MLC變化的影響。將HASMC放入10℃的全溫培養(yǎng)箱孵育4小時，采用qRT-PCR法檢測TRPM8及TRPA1 mRNA水平變化，檢測不同濃度的Z-藁本內酯或阿魏酸對其的抑制作用，根

13、據 ED50確定聯合用藥的藥物濃度，使用軟件Calcusyn計算不同藥效下的合并指數。
　　結果：WS-12及ASP7663均可引起HASMC細胞內鈣離子濃度的升高，前者與外鈣內流及RyR受體內鈣釋放有關，后者與外鈣內流及RyR受體/IP3受體的內鈣釋放有關。在排除CICR的影響后，阿魏酸及Z-藁本內酯對WS-12或ASP7663引起的熒光變化成濃度依賴性的抑制作用，ED50值分別為（9.124±1.04μM）及（6.836±1.

14、13μM），根據ED50值確定混合藥物濃度梯度，合并指數CI＜1。ASP7663可引起HASMC RhoA活性及p-MLC/t-MLC增加，WS-12可引起p-MLC/t-MLC增加，阿魏酸、Z-藁本內酯及混合藥物組均可顯著抑制ASP7663或WS-12引起的變化，與阿魏酸組或 Z-藁本內酯組相比，混合藥物組對 MLC磷酸化水平有更明顯的抑制作用。低溫（10℃，4小時）可顯著增加HASMC TRPM8 mRNA水平，阿魏酸及Z-藁本內酯

15、均能顯著減少TRPM8 mRNA的增加，ED50分別為（3.416±1.05μM）及（2.325±1.06μM），根據ED50值確定混合藥物濃度梯度，合并指數CI＜1。
　　結論：TRPM8或TRPA1的激活均可引起胸主動脈平滑肌細胞的收縮，前者主要通過鈣依賴途徑引起細胞收縮，后者則可以同時激活鈣依賴性途徑及鈣敏感性途徑中的關鍵靶點RhoA激酶。低溫可顯著增加TRPM8 mRNA表達。阿魏酸及Z-藁本內酯對上述作用靶點具有協同抑制