多次食管酸灌注對哮喘小鼠氣道炎癥表型及TRPA1受體的影響.pdf

1、[目的]：
　　1.制作胃食管反流（Gastroesophageal reflux，GER）及哮喘小鼠模型;
　　2.觀察胃食管反流小鼠、哮喘小鼠、胃食管反流合并哮喘小鼠體內(nèi)細胞因子蛋白濃度水平及肺組織中瞬時受體電位離子通道蛋白A1(Transient receptorpotential A1，TRPA1)的分布及表達量;
　　3.研究胃食管反流相關(guān)哮喘小鼠的氣道炎癥表型及TRPA1在其中的作用。
　　[方法]：

2、
　　將60只8～9周齡、體重相似的清潔級雄性BALB/c小鼠隨機分成6小組，分別為正常組、灌鹽組、灌酸組、哮喘組、哮喘灌鹽組、哮喘灌酸組，每組10只小鼠。通過腹腔注射和霧化吸入雞卵白蛋白(Ovalbumin, OVA)建立哮喘小鼠模型;通過食管下段灌注人工胃液建立胃食管反流小鼠模型，灌鹽組即用生理鹽水代替人工胃液。完成整個造模過程后24小時處死小鼠。收集小鼠血清、肺泡灌洗液、食管中下段組織、肺組織;肺泡灌洗液(Bronchoal

3、veolar lavage fluid, BALF)細胞沉淀做細胞總數(shù)及分類計數(shù)，上清液用BCA蛋白檢測方法檢測蛋白濃度和用ELISA檢測方法檢測白介素-5(Interleukin-5，IL-5)、白介素-8(Interleukin-8，IL-8)蛋白濃度;血清用ELISA檢測方法檢測IL-5、IL-8蛋白濃度;食管組織和肺組織用于做石蠟切片，經(jīng)HE染色后觀察組織形態(tài)學(xué)改變情況;肺組織石蠟切片用免疫組化方法檢測TRPA1的分布和表達情況

4、。
　　[結(jié)果]：
　　1.食管組織HE染色
　　胃食管反流小鼠，包括灌酸組、哮喘灌酸組小鼠的食管組織發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，粘膜上皮局部增生，固有層有炎癥細胞浸潤，腺體肥大，但未見明顯潰瘍形成。非胃食管反流小鼠，包括正常組、灌鹽組、哮喘組、哮喘灌鹽組小鼠的食管組織層次結(jié)構(gòu)清晰，未發(fā)生明顯形態(tài)學(xué)的改變。
　　2.肺組織HE染色
　　哮喘小鼠，包括哮喘組、哮喘灌鹽組、哮喘灌酸組小鼠的氣道和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、破壞，可見異常

5、分泌物，氣道上皮組織破壞、脫落，粘膜充血、水腫，管腔變狹窄，腺體肥大，氣道和血管周圍可見大量炎癥細胞滲出、浸潤，其中哮喘組與哮喘灌鹽組小鼠以嗜酸性粒細胞滲出浸潤為主;哮喘灌酸組小鼠以中性粒細胞滲出浸潤為主，而且炎癥表現(xiàn)最為嚴(yán)重。胃食管反流小鼠，包括灌酸組及哮喘灌酸組小鼠的肺組織可見炎癥細胞滲出浸潤，以中性粒細胞滲出浸潤為主。正常組小鼠肺組織層次結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯形態(tài)學(xué)的改變。灌鹽組小鼠肺組織可見輕度炎癥。
　　3.BALF中細胞總

6、數(shù)及分類計數(shù)
　　哮喘小鼠包括哮喘組、哮喘灌鹽組、哮喘灌酸組小鼠BALF中的細胞總數(shù)較正常組升高，嗜酸性粒細胞、中性粒細胞比例較正常組均升高。灌酸組小鼠BALF中的細胞總數(shù)、中性粒細胞較正常組、灌鹽組均升高(P＜0.05或P＜0.01);哮喘組、哮喘灌鹽組小鼠BALF中的嗜酸性粒細胞比例較正常組、灌鹽組、灌酸組、哮喘灌酸組均升高明顯(P＜0.05或P＜0.01);哮喘灌酸組小鼠BALF中的細胞總數(shù)、中性粒細胞比例較正常組、灌鹽組、

7、灌酸組、哮喘組、哮喘灌鹽組均升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　4.BALF中總蛋白濃度
　　哮喘小鼠包括哮喘組、哮喘灌鹽組、哮喘灌酸組小鼠BALF中的總蛋白濃度較正常組明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)，其中以哮喘灌酸組小鼠升高最為明顯，較灌鹽組、灌酸組、哮喘組、哮喘灌鹽組均升高(P＜0.05或P＜0.01)。哮喘組、哮喘灌鹽組小鼠分別較灌鹽組、灌酸組均升高(P＜0.05)。
　　5.小鼠體內(nèi)IL-5、IL

8、-8蛋白濃度變化
　　BALF、血清中的IL-5:哮喘小鼠BALF及血清中的IL-5蛋白濃度明顯升高，哮喘組、哮喘灌鹽組、哮喘灌酸組小鼠分別較正常組、灌鹽組、灌酸組均升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　BALF、血清中的IL-8: BALF中IL-8，哮喘組與哮喘灌鹽組小鼠較正常組、灌鹽組、灌酸組均升高，哮喘灌酸組小鼠較正常組、灌鹽組、灌酸組、哮喘組、哮喘灌鹽組均升高(P＜0.05或P＜0.01);血清中IL-8，灌酸

9、組小鼠較正常組、灌鹽組均升高，哮喘組與哮喘灌鹽組小鼠較正常組、灌鹽組、灌酸組均升高，哮喘灌酸組小鼠較正常組、灌鹽組、灌酸組、哮喘組、哮喘灌鹽組均升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　6.免疫組化標(biāo)記小鼠肺組織TRPA1的分布及表達;
　　TPRA1在小鼠的氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、炎癥細胞胞漿內(nèi)均可見表達，顯微鏡下呈現(xiàn)黃色或棕黃色;其中灌酸組、哮喘組、哮喘灌鹽組、哮喘灌酸組小鼠較正常組、灌鹽組的表達量明顯

10、升高，以哮喘灌酸組小鼠升高尤為突出(P＜0.05或P＜0.01)。
　　[結(jié)論]：
　　1.依據(jù)食管和肺組織病理結(jié)果，說明建立胃食管反流及哮喘小鼠模型成功;
　　2.本實驗通過建立胃食管反流并哮喘小鼠模型進一步證實胃食管反流相關(guān)哮喘是以中性粒細胞為主的氣道炎癥表型，與過敏性哮喘不同;胃食管灌注人工胃液可引起肺部炎癥加重，哮喘病理改變加重;
　　3.推測GER導(dǎo)致正常或哮喘小鼠氣道炎癥可能與肺組織上的TRPA1受體