戈壁異常球菌I-0冷激蛋白的功能鑒定及異源表達(dá).pdf

1、溫度是主要的環(huán)境脅迫因子。低溫脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞合成大量小分子的冷激蛋白(cold shockprotein,Csp)。這類蛋白在增強(qiáng)低溫脅迫抗性方面具有重要的作用,但是冷激蛋白對UV輻射、高滲等脅迫抗性作用的研究報(bào)道甚少。極端耐輻射戈壁異常球菌(Deinococcus gobiensis I-0)分離于干旱、溫差大及強(qiáng)陽光輻射的戈壁沙漠環(huán)境,具有超強(qiáng)的紫外(UV)輻射、電離輻射和干燥等脅迫抗性。本研究克隆了戈壁異常球菌I-0的冷激蛋白基因,

2、在模式菌大腸桿菌(E.coli)中研究其增強(qiáng)細(xì)胞非生物脅迫抗性的機(jī)制。
　　 在完成該菌全基因組測序與注釋的基礎(chǔ)上,通過氨基酸序列比對,2個預(yù)測的冷激蛋白(Csp1和Csp2)與枯草芽孢桿菌的CspB一致性最高(64％和69％)。同源建模結(jié)果顯示,Csp1與Csp2也具有冷激蛋白家族特有的結(jié)構(gòu),即5個反向平行β折疊片形成β桶狀結(jié)構(gòu),含有兩個保守的單鏈核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
　　 構(gòu)建csp1與csp2的表達(dá)載體,分別在大腸桿

3、菌中表達(dá)。非誘導(dǎo)條件下,異源表達(dá)Csp1與Csp2的大腸桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗冷凍和低溫生長能力。誘導(dǎo)條件下,過量表達(dá)影響細(xì)胞的生長速度。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Csp1、Csp2能夠與ssDNA結(jié)合。以上結(jié)果表明,Csp1與Csp2屬于典型的冷激蛋白家族成員。
　　 進(jìn)一步研究了Csp1與Csp2異源表達(dá)對大腸桿菌在M9限制性培養(yǎng)基中的生長以及耐受UV輻射和鹽脅迫能力的影響。結(jié)果表明,Csp1與Csp2的表達(dá)能顯著增強(qiáng)大腸桿菌細(xì)胞在

4、營養(yǎng)缺乏條件下的生長能力,UV輻射處理后,Csp2異源表達(dá)細(xì)胞UV輻射耐受能力比對照細(xì)胞高出2個數(shù)量級,4M NaCl沖擊2h或3M山梨醇沖擊2h后,Csp2異源表達(dá)細(xì)胞滲透脅迫能力比對照細(xì)胞高出1個數(shù)量級。RT-PCR結(jié)果顯示,150J／m2輻射條件下,相對于對照大腸桿菌細(xì)胞,Csp2異源表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)堿基切除修復(fù)途徑相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào),尤其核酸內(nèi)切酶Ⅷ基因nei的表達(dá)水平上調(diào)了5倍,推測Csp2可能增強(qiáng)堿基切除修復(fù)能力。1M Na

5、Cl沖擊條件下,Csp2異源表達(dá)細(xì)胞內(nèi)甜菜堿合成酶基因betA、betB與betT表達(dá)顯著上調(diào),同時海藻糖合成酶基因otsA與otsB表達(dá)上調(diào),而海藻糖降解基因treB與treC的表達(dá)下調(diào),推測Csp2蛋白可能增強(qiáng)滲透保護(hù)物質(zhì)的合成。
　　 構(gòu)建了CaMV35S啟動子驅(qū)動的csp2基因表達(dá)的載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化煙草,經(jīng)PCR,Southern及Western雜交等驗(yàn)證csp2基因整合到煙草基因組中并成功表達(dá),20％PE