大腸桿菌異源表達(dá)ChSase ABC I及合成芳香族化合物.pdf

1、大腸桿菌(E.coli)作為一種宿主菌，具有基因操作簡(jiǎn)單，繁殖快等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室中被當(dāng)作首選宿主用來(lái)表達(dá)外源酶和合成重要化學(xué)物。基于此，本研究選擇E.coli作為宿主菌，實(shí)現(xiàn)了異源硫酸軟骨素裂解酶ABCⅠ(ChSase ABCⅠ)的高效表達(dá)和重要芳香族化合物的生物合成。
　　ChSase ABCⅠ是一種能將大分子量硫酸軟骨素(CS)降解成小分子量CS的多糖裂解酶。本研究將融合標(biāo)簽麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)與ChSaseABCⅠ進(jìn)行融

2、合，實(shí)現(xiàn)了MBP-ChSase ABCⅠ的可溶性表達(dá)。通過(guò)表達(dá)宿主優(yōu)化，其產(chǎn)量能達(dá)到3180.0±19.0IU/L fermentation liquor，同時(shí)探究了融合標(biāo)簽對(duì)ChSase ABCⅠ性質(zhì)的影響。其次，系統(tǒng)探究了工業(yè)常用His標(biāo)簽對(duì)ChSase ABCⅠ性質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)His標(biāo)簽未對(duì)ChSase ABCⅠ的聚合狀態(tài)、最適作用溫度和pH產(chǎn)生影響。但是降低ChSase ABCⅠ的催化效率和比酶活。為提高ChSase ABCⅠ對(duì)

3、CS B的活性，我們通過(guò)序列比對(duì)和分子模擬分析結(jié)構(gòu)，用定點(diǎn)突變的方法，得到了對(duì)底物CS B活性比野生型高的ChSase ABCⅠ的突變體。
　　此外為進(jìn)一步提高ChSase ABCⅠ的表達(dá)量和酶活，我們發(fā)掘了一種新的融合標(biāo)簽3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，該酶是糖酵解途徑中不可缺少的一種酶。另外，其在實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)中常被用作內(nèi)參基因，原因在于其在表達(dá)時(shí)幾乎不受實(shí)驗(yàn)條件的干擾。隨后，我們將該標(biāo)簽與ChSa

4、se ABCⅠ融合表達(dá)后，結(jié)果顯示融合有GAPDH標(biāo)簽的ChSase ABCⅠ，其表達(dá)水平和酶活比未融合的ChSase ABCⅠ分別提高了2.3和3.0倍。經(jīng)過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，GAPDH-ChSase ABCⅠ產(chǎn)量能夠達(dá)到28488.6±2143.3IU/L fermentation liquor(880.0±61.0IU/g wet cell weight)，該產(chǎn)量也是目前報(bào)道的最高水平。同時(shí)研究了融合標(biāo)簽GAPDH對(duì)Ch

5、Sase ABCⅠ性質(zhì)的影響，GAPDH未對(duì)其最適溫度和pH產(chǎn)生明顯影響，但對(duì)其比酶活和催化效率產(chǎn)生了負(fù)面影響。
　　本論文另一研究重點(diǎn)是利用E.coli為宿主菌，實(shí)現(xiàn)了多種芳香族化合物的生物合成，其中包括木質(zhì)素單體醇類，香草醇和沒(méi)食子酸。木質(zhì)素單體醇類化合物，包括香豆醇，芥子醇，咖啡醇和松柏醇，是木質(zhì)素合成的直接前體，其衍生物具有不同的生理和藥理功能。我們?cè)O(shè)計(jì)了高效生產(chǎn)木質(zhì)素單體醇的代謝途徑，發(fā)酵后，香豆醇的產(chǎn)量達(dá)501.8±4

6、1.4mg/L，比之前報(bào)道高出將近10倍。對(duì)于咖啡醇和松柏醇的合成，為避免副反應(yīng)發(fā)生造成碳源流失，我們利用了細(xì)胞膜能給L-酪氨酸提供一種屏障的作用，引入共培養(yǎng)的方法。經(jīng)過(guò)接種比例優(yōu)化，咖啡醇的產(chǎn)量達(dá)到401.0±15.3mg/L，比單獨(dú)培養(yǎng)生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量高出將近12倍。同時(shí)，經(jīng)過(guò)放大實(shí)驗(yàn)，其產(chǎn)量達(dá)到854.1±44.6mg/L。利用同樣的方法，松柏醇的產(chǎn)量達(dá)到124.9±5.1mg/L。
　　香草醇，一種天然酚類化合物，是一種被廣

7、泛使用的香味劑。為實(shí)現(xiàn)其首次生物合成，首先我們對(duì)咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)的底物多樣性進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)COMT能夠催化新底物3，4-二羥基苯甲醇生成香草醇。其次，基于此，我們利用COMT設(shè)計(jì)了一條香草醇的非天然合成途徑，并轉(zhuǎn)化到宿主E.coli中，能生產(chǎn)240.7±22.2mg/L香草醇。
　　沒(méi)食子酸，作為酚酸類化合物的一種，普遍存在于多種植物中具有超強(qiáng)的抗氧化作用。為避免其提取生產(chǎn)過(guò)程中的缺點(diǎn)，我們報(bào)道了一種全新的方法

8、來(lái)有效生產(chǎn)沒(méi)食子酸。首先通過(guò)結(jié)構(gòu)分析和定點(diǎn)突變，我們獲得了新的p-羥基苯甲酸羥基化酶(PobA)突變體。該突變體對(duì)底物3，4-二羥基苯甲酸的kcat為1.7±0.2s-1，比野生型和其他報(bào)道的突變體都高，且對(duì)底物4-羥基苯基酸的活性得到了最大保留。隨后，我們將此突變體引入到?jīng)]食子酸合成途徑中，有1266.4±51.8mg/L沒(méi)食子酸從簡(jiǎn)單的碳源產(chǎn)出。
　　本研究，以E.coli為宿主菌，我們實(shí)現(xiàn)了ChSase ABCⅠ的異源表達(dá)，