四膜蟲Tetrahymenaelliotti兩種金屬硫蛋白的異源表達(dá)和功能比較.pdf

1、金屬硫蛋白（ MTs）是一類低分子量、富含半胱氨酸并能夠螯合金屬離子的蛋白。纖毛蟲MTs與高等生物中的MTs相比，結(jié)構(gòu)和功能上具有特殊性和多樣性。四膜蟲MTs屬于第7家族，由不同的串聯(lián)重復(fù)的模塊組成，其序列與哺乳動物相比保守性不高，且序列長度較長。四膜蟲 MTs在串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)上的差異，導(dǎo)致不同 MT亞型抵抗金屬離子的能力也存在差異。四膜蟲Tetrahtmena elliotti中存在兩種不同亞型的MT基因Te-MTT2-L及Te-MTT

2、2-S，本研究以這兩種不同長度的MT為基礎(chǔ)分析金屬硫蛋白序列長度與其解毒能力的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：
　　1. Te-MTT2-L和Te-MTT2-S的鑒定通過PCR擴(kuò)增出Te-MTT2-L和Te-MTT2-S兩種基因。Te-MTT2-L（447 bp）編碼149個氨基酸，Te-MTT2-S（273 bp）編碼90個氨基酸，兩基因序列中均無內(nèi)含子。通過對Te-MTT2-L和Te-MTT2-S中的氨基酸序列的模塊進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)這兩

3、種基因具有典型的銅離子誘導(dǎo)型金屬硫蛋白的結(jié)構(gòu)特征，應(yīng)屬于7b亞家族的成員。
　　2. Te-MTT2-L和Te-MTT2-S在大腸桿菌中的融合表達(dá)突變大腸桿菌終止密碼子后，分別構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pGST-Te-MTT2-L、 pGST-Te-MTT2-S和pSUMO-Te-MTT2-L、pSUMO-Te-MTT2-S。轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21后，0.05 mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)4 h表達(dá)出與 GST和 SUMO融合表達(dá)的

4、Te-MTT2-L/S蛋白， SDS-PAGE結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：與 GST標(biāo)簽相比，SUMO標(biāo)簽?zāi)茱@著提高 Te-MTT2-L和 Te-MTT2-S蛋白在上清中的表達(dá)量，并提高其可溶性。SUMO-Te-MTT2-L和SUMO-Te-MTT2-S經(jīng) Ni柱親和純化獲得電泳純的蛋白。85℃，15 min溫浴后， SUMO-Te-MTT2-L和SUMO-Te-MTT2-S蛋白在10mmol/L PBS溶液中穩(wěn)定存在。結(jié)果表明：結(jié)果表明SUMO表達(dá)

5、系統(tǒng)提高了Te-MTT2-L和Te-MTT2-S的可溶性表達(dá)。
　　3.重組大腸桿菌對 Cu2+和 Cd2+的耐受性比較在大腸桿菌BL21/pGST-Te-MTT2-L、BL21/pGST-Te-MTT2-S和BL21/ SUMO-Te-MTT2-L、BL21/SUMO-Te-MTT2-S對Cu2+和Cd2+的耐受性實(shí)驗(yàn)中，融合表達(dá)長鏈MT的重組大腸桿菌BL21/ SUMO-Te-MTT2-L對Cu2+和Cd2+的耐受性最高。這表

6、明金屬硫蛋白的序列越長其解毒能力越強(qiáng)，對細(xì)胞抵抗逆境環(huán)境更有利。
　　4.重組大腸桿菌BL21/ SUMO-Te-MTT2-L對Cu2+和Cd2+的螯合能力顯著提高用X-射線熒光光譜儀檢測重組大腸桿菌對Cu2+和Cd2+的螯合情況，單位干重的重組大腸桿菌BL21/pSUMO-Te-MTT2-L螯合Cu2+的能力是BL21/pE-SUMO的10倍；螯合Cd2+的能力是BL21/pE-SUMO的1.6倍，并且對Cu2+和Cd2+的螯合

7、主要發(fā)生在前5個小時。BL21/pSUMO-Te-MTT2-S螯合Cu2+的能力是BL21/pE-SUMO的6.5倍，螯合 Cd2+的能力是 BL21/pE-S UMO的1.4倍，但此螯合過程與BL21/pSUMO-Te-MTT2-L相比相對緩慢，長序列的 Te-MTT2-L與短序列的Te-MTT2-S相比，能在較短時間內(nèi)螯合更多的金屬離子。
　　本研究首次從四膜蟲Tetrahtmena elliotti中鑒定得到兩種新的CuMT