人腦金屬硫蛋白MT3結(jié)構(gòu)對其性質(zhì)和功能的影響.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文人腦金屬硫蛋白MT3結(jié)構(gòu)對其性質(zhì)和功能的影響姓名：鄭起申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：無機(jī)化學(xué)指導(dǎo)教師：黃仲賢20030508應(yīng)的速率常數(shù)約為MTl的四倍，這進(jìn)一步證明MT3中的金屬硫簇較MTl中的更不穩(wěn)定，部分金屬硫鍵更弱。MT3與DTNB的反應(yīng)也比MTl要快，這～結(jié)果顯示MT3中的金屬硫簇暴露于溶劑中的程度更大，這部分是由于其p一結(jié)構(gòu)域本身結(jié)構(gòu)較為松散，同時還源于其D結(jié)構(gòu)域中特有的CPCPmotif，兩個連續(xù)的Pro使蛋

2、白肽鏈在此產(chǎn)生明顯的彎折，導(dǎo)致金屬硫簇更加暴露。我們推測，這種暴露性對于MT3的性質(zhì)和功能有著決定性的意義。此外，MT3也更容易被生物酶所降解，如采用Trypsin進(jìn)行1周的模擬消化，MTl能夠維持完整結(jié)構(gòu)不被破壞的約占60％，而等同條件下仍能保持完整的MT3只有約18％。為了揭示性質(zhì)差異的起源，我們通過多種譜學(xué)方法來考察了Cd7MT3的結(jié)構(gòu)。實(shí)驗結(jié)果表明，Cd7一MT3能夠很好保持其結(jié)構(gòu)的完整性，UV、cD光譜都呈現(xiàn)出特征的金屬硫簇電

3、荷轉(zhuǎn)移吸收帶，沒有明顯的氧化朕兆。Raman光譜顯示，蛋白中的巰基都參與了金屬離子的配位，既不存在自由的巰基，也沒有二硫鍵形成。然而，與MTl相比，MT3的結(jié)構(gòu)明顯比較松散。柱層析的結(jié)果顯示，MT3的Stoke’S半徑較大，在等同實(shí)驗條件下其保留時間較短。通過NMR對蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析可以說明為什么存在這種松散性。研究發(fā)現(xiàn)：MT3中a名；構(gòu)域折疊較為緊密，而B一結(jié)構(gòu)域中長程N(yùn)OE信號非常少。0【結(jié)構(gòu)域中，除53—60位以外，蛋白的肽

4、鏈可變性都不大且總體走向與MTl極為相似，然而，G53一E60一段肽鏈卻沒有一種能量上占明顯優(yōu)勢的構(gòu)象，它可以隨環(huán)境條件的變動較為靈活的調(diào)整。這點(diǎn)是造成MT3獨(dú)特性質(zhì)的重要因素之一。同時，柔性的G53一E60肽段也可能是蛋白一蛋白相互作用中理想的結(jié)合位點(diǎn)。與Cd7一MT3相比，Zn7一MT3的穩(wěn)定性明顯較低，其酸滴定曲線的突躍中點(diǎn)大約在49而且Zn”在pH70時就開始發(fā)生解離。在pH60時重組、純化的Zn7MT3在Raman光譜上可明顯

5、看到507nm處的二硫鍵吸收。Zn7MT3與EDTA的反應(yīng)速率比Cd7一MT3要快得多，EDTA濃度為1mM時，其快反應(yīng)速率為5110≈s～，約是Cd7MT3(11210。s。1)的4倍，而同DTNB的反應(yīng)速率則與Cd7MT3相近，預(yù)示著金屬硫簇的暴露程度Zn7一MT3與Cd7一MT3差不多。為了進(jìn)一步求證其結(jié)構(gòu)對性質(zhì)和功能所產(chǎn)生的影響，我們有目的地構(gòu)建了～系列突變體蛋白。通過對突變體蛋白和野生型MT3的比較，我們可以進(jìn)～步加深對MT3

6、結(jié)構(gòu)一性質(zhì)一功能之間相互關(guān)系的認(rèn)識。MT3在一級結(jié)構(gòu)上最顯著的特征之一就是在第5560位之間插入了一段富含Glu的六肽，為考察這個酸性六肽loop對蛋白性質(zhì)的影響，我們構(gòu)建了一組突變體，包括六肽缺失突變體△E(55)E(60)，酸性殘基置換突變體E55158t60Q和E58K，以及cc—helixmaker或breaker的突變體G53／54A和E55D，A56G，A56G，E58D／A59G，E60D，A61G／E62D。通過對比上述