金屬硫蛋白對肝星狀細(xì)胞增殖影響的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：觀察金屬硫蛋白（Metallothionein1A/2A，MT1A/2A）對肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）增殖的影響。 方法：①構(gòu)建金屬硫蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3．1-MT1A/pcDNA3．1-MT2A，重組質(zhì)粒純化后，酶切及測序鑒定。②通過轉(zhuǎn)染試劑fuGENE-6將pcDNA3．1-MT1A/pcDNA3．1-MT2A轉(zhuǎn)染到大鼠肝星狀細(xì)胞（HSC-T6），細(xì)胞培養(yǎng)24-48小時后，

2、加含400μg/ml G418的DMEM篩選2-3周。③分別用RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測MT1A/2A mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)，以確定MT是否有過表達(dá)。④AgNOR染色法及MTT法檢測HSCs增殖指數(shù)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測HSCs細(xì)胞周期的變化。 結(jié)果：①經(jīng)酶切及測序鑒定，所克隆的基因片段與預(yù)期完全一致，序列無堿基突變，成功構(gòu)建pcDNA3．1-MT1A/pcDNA3．1-MT2A真核表達(dá)質(zhì)粒。②RT-PCR結(jié)果顯示：

3、轉(zhuǎn)染pcDNA3．1-MT1A/pcDNA3．1-MT2A組的MT1A/2A mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，免疫細(xì)胞化學(xué)方法染色顯示：轉(zhuǎn)染目的基因組MT1A/2A染色胞漿呈棕黃色深染，而未轉(zhuǎn)染組及pcDNA3．1組細(xì)胞漿呈淡染，表明MT能在轉(zhuǎn)染的HSCs內(nèi)過表達(dá)。⑨AgNOR染色法及MTT法結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染pcDNA3．1組及未轉(zhuǎn)染組相比，MT過表達(dá)的HSCs增殖明顯加快，細(xì)胞增殖指數(shù)增高。用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，結(jié)果表明，MT過表達(dá)的H