金屬硫蛋白拮抗細菌脂多糖急性肝損傷的機制研究.pdf

1、細菌脂多糖(LPS)是一類由革蘭氏陰性桿菌產生的內毒素。在感染等情況下，大量LPS進入機體可引發(fā)全身多器官炎癥反應。低劑量的LPS同樣也可以導致機體的損傷。由于肝臟是清除內毒素的主要場所，肝臟成為內毒素引起的全身炎癥反應中最易受損的器官之一。因此，研究LPS引起的炎癥反應與肝臟損傷的關系具有十分重要的現實意義。 金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在于生物體內富含半胱氨酸、低分子量的、可被金屬誘導產生的金屬結合蛋白。MT在重金屬解毒，

2、維護機體內穩(wěn)態(tài)，增強機體適應能力等方面發(fā)揮著重要的生物學作用，是一種可以抵抗外源性損傷的細胞防御性蛋白。Tomoki等發(fā)現MT基因敲除小鼠對LPS引起的炎癥反應較與之對應的野生型小鼠更為敏感，提示MT在LPS引起的炎癥損傷中發(fā)揮一定的保護作用，但其具體機制目前尚不清楚。 本研究通過觀察MT(MT-Ⅰ、MT-Ⅱ)基因敲除(MT-/-)小鼠、與相對應的野生型(MT+/+)小鼠以及以硫酸鋅(ZnSO4)誘導形成的MT高表達小鼠三種動物

3、模型對LPS引起的急性肝臟損傷程度的比較。進而以肝臟KC細胞特異性抑制劑氯化釓(GdCl<,3>)抑制KC活性，應用NF-кB特異性抑制劑四氫化吡咯二硫代氨基甲酸脂(PDTC)抑制NF-кB的轉錄活性，探討KC細胞、NF-кB信號通路在LPS致肝臟急性炎癥過程中的作用及MT的調控作用。初步探討金屬硫蛋白在LPS引發(fā)急性肝臟損傷中的作用及其可能機制。本課題包括以下兩個部分： 第一部分：MT對LPS致急性肝臟炎性損傷的影響

4、使用MT基因敲除(MT-/-)小鼠、野生型(MT+/+)小鼠為動物模型，采用鎘飽和法測定MT含量，確證動物模型可靠性。腹腔注射不同劑量LPS(1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)24小時后處死動物，以10mg/kg劑量腹腔注射LPS分別在3h、6h、12h、24h、48h后處死動物，每組6只動物。通過組織病理學、血液生化分析比較觀察不同MT表達水平動物模型對LPS致急性肝臟炎癥損傷的敏感性差異。采用ELISA法測

5、定細胞因子含量，GRIESS法檢測NO含量，觀察不同MT表達水平動物模型中上述具有細胞毒性效應炎性介質表達的差異。通過脂質過氧化產物、蛋白質過氧化產物的測定，從自由基損傷角度初步觀察MT對LPS致肝臟炎癥損傷保護效應的可能機制。 結果表明，LPS可以使兩種小鼠ALT、AST等血清酶活性均呈時間、劑量依賴性升高。組織病理學檢查顯示，肝臟出現肝細胞濁腫，空泡變性、灶性液化壞死、星狀細胞增生。細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表

6、達上調，血清以及肝臟組織內NO含量增加。肝臟內脂質過氧化產物增加。MT+/+小鼠血清ALT，AST等升高趨勢較MT-/-小鼠更為顯著。炎癥反應早期MT-/-小鼠肝組織內炎性細胞浸潤程度輕于MT+/+小鼠，隨炎癥反應時間延長，MT-/-小鼠較MT+/+小鼠肝組織損傷程度呈加重趨勢。LPS作用下，MT-/-小鼠較MT+/+小鼠細胞因子、NO等細胞毒性炎性介質表達上調趨勢更為顯著。LPS致MT-/-小鼠肝臟脂質過氧化程度較MT+/+小鼠更為嚴

7、重。結論MT對LPS引起的肝臟損傷具有保護作用，其可能機制與MT對L2S以及對LPS致炎過程中生成的ROS的清除作用以及MT表達水平導致機體對外源性LPS刺激清除作用不同有關。 以Zn(ZnSO<,4> 300μmol/kg s.c.連續(xù)給藥兩天)作為誘導劑形成MT的高表達小鼠為動物模型，通過鎘飽和法測定肝組織內MT含量，通過血液生化活性分析。肝臟組織病理學檢查、細胞因子、NO測定、脂質過氧化產物檢測，比較觀察MT表達增高是否有

8、利于機體抵抗LPS致急性肝臟炎性損傷。結果表明，Zn可以顯著增加野生型小鼠肝組織內MT含量，對敲除型小鼠肝組織內MT含量無影響。Zn預處理可以顯著降低野生型小鼠血清酶升高趨勢，可以有效減輕野生型小鼠肝組織病理損傷程度，減少細胞因子、NO等細胞毒性炎性介質的生成，減輕肝組織脂質過氧化損傷程度。Zn預處理對MT敲除型小鼠弱于野生型小鼠。上述結果進一步說明MT對LPS致肝臟損傷具有一定的保護效應，其可能作用機制與其影響細胞毒性炎性介質的生成以

9、及直接清除致炎過程中生成的大量活性氧自由基有關。 第二部分：Kupffer細胞及NF-кB在MT對LPS致肝臟炎癥損傷保護效應中的作用 采用KC特異性抑制劑氯化釓GdCl<,3>，觀察其對LPS引起的兩種小鼠急性肝臟損傷的影響。將MT基因敲除小鼠(MT-/-)及與之對應的野生型小鼠(MT+/+)各分為4組：生理鹽水對照組、LPS染毒組、GdCl<,3>組、GdCl<,3>預處理+LPS染毒組。動物腹腔注射LPS(10mg

10、/kg)或生理鹽水(NS)，此前24h給予GdCl<,3>(10mg/kg，i.v.)或NS預處理。注射LPS后24h測定鎘飽和法測定肝臟金屬硫蛋白(MT)含量，血清酶活力，進行肝組織病理學檢查，檢測-氧化氮(NO)，細胞因子含量，檢測肝組織脂質過氧化程度，判定不同處理對MT-/-小鼠及MT+/+小鼠肝臟的影響的差異。結果表明，氯化釓、LPS均可以誘導MT+/+小鼠肝臟MT生成。GdCl<,3>預處理可以降低LPS對MT-/-小鼠及MT

11、+/+小鼠血清中ALT，AST等酶活力，血清以及組織內NO、細胞因子含量的影響，可以減輕LPS對兩種小鼠肝組織病理學損傷，有效減輕LPS對MT-/-小鼠及MT+/+小鼠引起的肝臟損傷，其可能機制與其對肝臟Kupffer細胞抑制作用有關。同時GdCl3預處理消除了LPS致兩種基因型小鼠肝臟炎癥反應之間的差異，提示MT發(fā)揮這種保護作用的可能途徑是LPS與肝臟KC相互作用后的某個環(huán)節(jié)。采用NF-кB特異性抑制劑PDTC，觀察NF-кB在MT保

12、護LPS急性肝臟損傷中保護效應的作用，在注射LPS前30min，腹腔注射PDTC40mg/kg，LPS劑量為10mg/kg i.p.，作用24h后處死動物，結果觀察到PDTC可以有效降低兩種小鼠血清酶活性，減少血液中TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子，血清以及肝臟組織中NO含量，降低肝組織TNF-α表達量，同時減輕兩種小鼠肝臟組織病理學損傷程度，減輕肝組織內脂質過氧化產物生成量。既以PDTC預處理消除MT自由基清除作用對NF-к