南林895楊轉(zhuǎn)小鼠金屬硫蛋白(MT)基因研究.pdf

1、重金屬污染是影響環(huán)境質(zhì)量和生態(tài)穩(wěn)定的主要問題之一,它不僅影響大氣和水環(huán)境的質(zhì)量、農(nóng)作物的生長,而且通過食物鏈嚴(yán)重危害動物和人類的健康。由于重金屬污染的廣泛性及其自身不可降解的特點(diǎn),治理起來十分困難。哺乳動物金屬硫蛋白(Metallo theinoin,MT)是動物體內(nèi)能專性與重金屬結(jié)合的一類低分子量、高巰基含量的蛋白質(zhì),本研究以MT基因?yàn)槟康幕?選擇生物量大、生長迅速的植物(南林895楊)為基因轉(zhuǎn)移的靶植物,利用植物基因工程技術(shù)將目的

2、基因整合到靶植物基因組中,獲得轉(zhuǎn)MT基因楊樹,用于富集污染土壤中的有害重金屬,從而達(dá)到修復(fù)生態(tài),從源頭上控制和減少重金屬進(jìn)入食物鏈,更大范圍內(nèi)防治動物和人類重金屬中毒發(fā)生的目的。
　　 實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了帶有小鼠金屬硫蛋白(MT)基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-MT,以南林895楊組織培養(yǎng)苗為受體植物,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,展開了小鼠金屬硫蛋白基因(MT)的植物遺傳轉(zhuǎn)化的前期研究,為最終獲得目的基因穩(wěn)定遺傳和高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基

3、因楊樹,利用MT結(jié)合重金屬的特性富集污染土壤中的重金屬提供基礎(chǔ)。
　　 1、植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-MT的構(gòu)建
　　 利用DNA重組技術(shù)將包含35S-35S啟動子、AMV、Tnos的MT基因表達(dá)框定向克隆至植物中間表達(dá)載體pCAMBIA2301中,該載體使用卡那霉素篩選基因,并增加了gus報(bào)告基因,新構(gòu)建的載體可通過根癌農(nóng)桿菌EHA105導(dǎo)入楊樹基因組,酶切和PCR鑒定表明質(zhì)粒成功構(gòu)建。
　　 2、農(nóng)

4、桿菌轉(zhuǎn)染后楊樹葉盤脫菌用抗生素種類和濃度的確定
　　 使用四種抗生素(羧芐青霉素(Carbenicillin,Cb)、氨芐青霉素(Ampieillin,Amp)、頭孢霉素(Cefotaxime,Cef)、替卡西林克拉維酸鉀(Timentin,Tim))進(jìn)行外植體脫菌的抗生素篩選實(shí)驗(yàn),確定使用濃度為200mg/L的頭孢霉素(Cefotaxime,Cef)時,既不會影響南林895楊葉盤的分化效率,又能夠有效抑制農(nóng)桿菌的生長。

5、　　 3、真空滲透法轉(zhuǎn)染農(nóng)桿菌條件的確定
　　 根據(jù)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染葉盤后GUS染色的結(jié)果,確定在楊樹葉盤預(yù)培養(yǎng)3d,菌液濃度OD6000.5,真空抽吸5min,共培養(yǎng)2d的轉(zhuǎn)化體系下,楊樹的轉(zhuǎn)化率最高。經(jīng)PCR檢測,獲得2株陽性苗。
　　 4、gus報(bào)告基因的表達(dá)
　　 植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-MT。在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染南林895楊后,其上帶有的gus報(bào)告基因成功表達(dá),經(jīng)X-Glue染色、70％乙醇脫色