周期蛋白Cyc28在嗜熱四膜蟲中的功能分析.pdf

1、真核生物的細(xì)胞周期通過連續(xù)激活和失活特定的周期蛋白/周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物活性進(jìn)行調(diào)控。在哺乳動物細(xì)胞周期中，周期蛋白A和周期蛋白B通過泛素化降解途徑使靶蛋白去磷酸化，促進(jìn)有絲分裂中期向后期轉(zhuǎn)化；周期蛋白D通過磷酸化Rb蛋白終止G1期，促進(jìn)細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化。
　　不同的生物體包含的周期蛋白類型不同，單細(xì)胞真核生物纖毛蟲表現(xiàn)出周期蛋白多樣性，表明單細(xì)胞生物體內(nèi)存在精細(xì)的調(diào)控機(jī)制。嗜熱四膜蟲含有1個(gè)小核和1個(gè)大核，小核為二倍體，在

2、營養(yǎng)生長期轉(zhuǎn)錄沉默，大核為多倍體，轉(zhuǎn)錄活躍，營養(yǎng)充足時(shí)細(xì)胞進(jìn)行無性生殖，饑餓條件下進(jìn)行有性生殖。有性生殖過程中，小核進(jìn)行減數(shù)分裂，產(chǎn)生4個(gè)原核，其中3個(gè)降解，另外1個(gè)原核進(jìn)行有絲分裂產(chǎn)生配子核，配子核交換，融合產(chǎn)生合子核。合子核通過有絲分裂產(chǎn)生新的大核和新小核，完成有性生殖。嗜熱四膜蟲含有34種周期蛋白，其中Cyc2, Cyc17和Cyc28在四膜蟲小核減數(shù)分裂期特異表達(dá)，Cyc2調(diào)控了小核減數(shù)分裂的起始，而Cyc17對減數(shù)分裂后期的起

3、始和同源染色體的分離是必需的，但是Cyc28的功能目前并不清楚。
　　本研究首次從嗜熱四膜蟲鑒定了有性生殖特異表達(dá)的周期蛋白基因CYC28，對其功能進(jìn)行了分析，主要結(jié)果如下：
　　1. CYC28生物信息學(xué)分析基于四膜蟲大核基因組數(shù)據(jù)庫（http//:www.ciliate.org）和功能基因組數(shù)據(jù)庫(http://tfgd.ihb.ac.cn）分析表明嗜熱四膜蟲 CYC28（TTHERM_00082190）基因全長1174

4、 bp，開放閱讀框801 bp，預(yù)測編碼266個(gè)氨基酸。RT-PCR產(chǎn)物測序分析表明CYC28序列正確。序列比對分析N端有一個(gè)由121個(gè)氨基酸組成的保守性周期蛋白框，周期蛋白框后有一個(gè)由9個(gè)氨基酸殘基組成的破壞框。周期蛋白框同源序列分析表明Cyc28可能屬于周期蛋白B3亞家族。Microarray表達(dá)譜和實(shí)時(shí)熒光定量檢測結(jié)果表明CYC28在營養(yǎng)生殖期和饑餓期不表達(dá)，在有性生殖期特異表達(dá)，4 h時(shí)表達(dá)量最高。
　　2. HA-Cyc

5、28的細(xì)胞定位及表達(dá)分析為研究Cyc28的功能，構(gòu)建帶有HA標(biāo)簽的表達(dá)載體 pXS75-CYC28，該表達(dá)載體由MTT1啟動子調(diào)控，在Cd2+誘導(dǎo)下高效表達(dá)，經(jīng)基因槍轉(zhuǎn)化，巴龍霉素濃度梯度篩選，選擇穩(wěn)定的細(xì)胞株。免疫熒光定位表明，Cyc28在有性生殖早期定位于細(xì)胞質(zhì)，在8 h定位在凋亡的舊大核上，表明Cyc28可能通過泛素化途徑，在凋亡的親本大核中降解或者直接參與了親本大核的凋亡。蛋白免疫印跡結(jié)果表明，HA-Cyc28在四膜蟲有性生殖0

6、 h沒有表達(dá)，2 h后表達(dá)上調(diào)，在4h和8h蛋白條帶變?nèi)?，可能部分發(fā)生泛素化降解，在16h配對分開后蛋白質(zhì)消失。
　　3.敲減CYC28對有性生殖進(jìn)程無顯著影響 CYC28是有性生殖期特異表達(dá)的基因，為進(jìn)一步分析Cyc28在嗜熱四膜蟲有性生殖過程中的功能，我們首先構(gòu)建了CYC28的敲除載體pNeo4-Δ-CYC28，轉(zhuǎn)化不同交配型的四膜蟲細(xì)胞，通過同源重組，篩選得到CYC28敲減細(xì)胞株。同野生型細(xì)胞相比，敲減株在有性生殖過程中，細(xì)

7、胞配對，小核拉伸，小核減數(shù)分裂以及原核選擇，合子核的有絲分裂都未見異常。由于未能獲得CYC28完全敲除的突變體細(xì)胞株，進(jìn)一步構(gòu)建了CYC28的干擾質(zhì)粒pCYC28hpCYH，該質(zhì)粒由Cd2+調(diào)控表達(dá)。干擾質(zhì)粒通過基因槍轉(zhuǎn)化四膜蟲，經(jīng)放線菌酮抗性梯度篩選，獲得不同交配型的突變體細(xì)胞株。qRT-PCR檢測得到穩(wěn)定的干擾株。觀察四膜蟲在有性生殖過程中核發(fā)育，結(jié)果表明小核發(fā)育過程未受影響，細(xì)胞配對，小核拉伸，減數(shù)分裂，配子核交換，新大核形成以及

8、結(jié)合后的個(gè)體均正常，表明Cyc28的敲減對有性生殖的進(jìn)程無顯著影響。
　　4.過表達(dá)Cyc28影響有性生殖期原核的有絲分裂在突變體細(xì)胞OE-CYC28-B和OE-CYC28-C配對后，CYC28基因的轉(zhuǎn)錄水平比野生型提高約10倍，觀察有性生殖過程，過表達(dá)Cyc28引起原核有絲分裂進(jìn)程的異常。同野生型相比，在有性生殖3.5h，45.5％細(xì)胞第一次減數(shù)分裂后期出現(xiàn)濃縮的染色體，未見染色體解聚后的小核；在4h，36.5%的細(xì)胞停留在第一

9、次減數(shù)分裂后期，31.5%細(xì)胞進(jìn)行的第二次減數(shù)分裂，小核松散；而在6h，大多數(shù)細(xì)胞選出的小核無法進(jìn)行有絲分裂；在8h，45.3%細(xì)胞中未出現(xiàn)新大核，在12 h，未出現(xiàn)發(fā)育完成的兩個(gè)大核一個(gè)小核的細(xì)胞。過量的外源Cyc28導(dǎo)致細(xì)胞核發(fā)育異常，原核有絲分裂受阻，有性生殖未能完成。
　　本研究首次鑒定了嗜熱四膜蟲周期蛋白基因CYC28，實(shí)時(shí)熒光定量PCR表明CYC28在有性生殖期特異表達(dá)。敲減CYC28不影響細(xì)胞的發(fā)育，而過表達(dá)CYC2