森林草莓鋅指蛋白ZFP介導(dǎo)SVBV P6蛋白泛素化的機制研究.pdf

1、病毒致病因子與寄主因子的互作對病毒致病性的影響一直是病毒分子生物學(xué)的一個研究熱點。SVBV P6蛋白是一個RNA沉默抑制子和癥狀決定子，與病毒的致病性緊密相關(guān)。但迄今為止，尚未見到SVBV P6蛋白與森林草莓蛋白互作的研究報道。本研究以SVBV P6為誘餌蛋白篩選感染SVBV森林草莓的酵母cDNA文庫，獲得與其互作的寄主因子鋅指蛋白ZFP。酵母雙雜交、雙分子熒光互補(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)試驗方法驗證了P6蛋白和ZFP蛋白

2、在體外和體內(nèi)互作;ZFP蛋白能夠影響P6蛋白在植物體內(nèi)聚集、表達以及減輕P6蛋白介導(dǎo)PVX在本氏煙上的癥狀表型;蛋白酶體抑制劑MG132能夠抑制ZFP介導(dǎo)P6蛋白的降解。本研究的開展對揭示SVBV P6蛋白與草莓鋅指蛋白ZFP互作分子機制以及寄主植物和雙鏈DNA病毒之間防御和反防御機理奠定了理論基礎(chǔ)。
　　1.P6蛋白與ZFP蛋白互作驗證
　　酵母雙雜交驗證P6與ZFP互作將pGAD-ZFP+pGBK-P6及pGAD-P6+

3、pGBK-ZFP分別共轉(zhuǎn)化酵母，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)化的酵母菌均能夠在選擇培養(yǎng)基平板上生長，說明P6能夠與ZFP互作。
　　BiFC驗證P6蛋白與ZFP蛋白互作含pCV-nYFP-P6+pCV-cYFP-ZFP和pCV-nYFP-ZFP+pCV-cYFP-P6的農(nóng)桿菌分別共浸潤本氏煙，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有完整的細胞出現(xiàn)黃色熒光，確認了P6蛋白能與ZFP蛋白在植物體內(nèi)互作。
　　Co-IP驗證P6與ZFP互作含pCM1307-myc-P6+

4、pCM1307-ZFP-flag的農(nóng)桿菌共浸潤本氏煙，Co-IP實驗后，western blot能夠檢測到ZFP蛋白和P6蛋白，說明P6蛋白與ZFP蛋白在植物體內(nèi)互作。
　　2.森林草莓鋅指蛋白ZFP基因的序列比較及分子進化分析
　　將本研究獲得的森林草莓ZFP基因與GenBank已登錄的其他植物的ZFP基因進行核甘酸序列相似性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，森林草莓鋅指蛋白ZFP的核苷酸序列與同屬薔薇科的梅花（P.mume）、白梨（P.b

5、retschneideri）和蘋果(M.domestica)的序列相似性較高，為88.6％-88.8％，與其他植物ZFP基因序列的相似性較低，為76.7％-84.6％。
　　構(gòu)建森林草莓ZFP基因和其他植物ZFP基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果表明森林草莓ZFP基因與同屬薔薇科植物的梅花(P.mume)、白梨（P.bretschneideri）和蘋果（M.domestica）ZFP基因單獨聚為一個分支，表明森林草莓ZFP基因與薔薇科植物Z

6、FP基因的親緣關(guān)系最近。
　　3.鋅指蛋白ZFP基因在SVBV感染的森林草莓中的差異表達
　　SVBV侵染性克隆接種森林草莓25天后，qPCR分析接毒草莓和接種空菌株草莓中ZFP基因的表達差異，結(jié)果表明SVBV能夠誘導(dǎo)ZFP表達上調(diào)。
　　4.鋅指蛋白ZFP亞細胞定位及其與P6蛋白共定位鑒定
　　含質(zhì)粒pCM2300-P6-GFP和pCM2300-ZFP-mCherry的農(nóng)桿菌共浸潤本氏煙，結(jié)果表明，ZFP蛋白能

7、夠定位于細胞質(zhì)、細胞核和細胞邊界，DAPI染色發(fā)現(xiàn)，P6蛋白能夠與ZFP蛋白共定位于細胞核和細胞邊界。
　　5.森林草莓鋅指蛋白ZFP介導(dǎo)P6在植物體內(nèi)泛素化降解研究
　　ZFP蛋白能夠影響P6蛋白聚集將含有pCAM2300-P6-GFP與pCM1307-ZFP-3*flag及pCAM2300-P6-GFP與空載體的農(nóng)桿菌共浸潤本氏煙，激光共聚焦觀察P6蛋白在植物體內(nèi)聚集情況。結(jié)果表明，P6蛋白與ZFP蛋白共浸潤時，P6蛋白

8、形成的聚集體明顯變小，且聚集的數(shù)量變少，說明ZFP蛋白能夠影響P6蛋白在植物體內(nèi)的聚集。
　　森林草莓ZFP蛋白影響P6蛋白在植物體內(nèi)表達將含有pCM1307-ZFP-3*flag與pCAM2300-P6-GFP的農(nóng)桿菌浸潤本氏煙，紫外燈下觀察pCAM2300-P6-GFP的亮度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P6蛋白與ZFP蛋白共浸潤之后，GFP熒光亮度比pCAM2300-P6-GFP與空載體共浸潤的亮度要低，說明ZFP蛋白在植物能夠干擾P6-GFP

9、的表達;提取浸潤區(qū)蛋白進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFP蛋白表達水平出現(xiàn)明顯降低，進一步檢測GFP的mRNA水平發(fā)現(xiàn)，GFP mRNA的表達水平?jīng)]有降低。
　　半體內(nèi)實驗檢測26S蛋白酶體抑制劑MG132對P6蛋白降解的抑制作用將含有pCAM2300-P6-GFP與pCM1307-ZFP-3*flag質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共浸潤本氏煙，anti-GFP抗體進行Western blot分析。與對照DMSO處理的樣品相比，MG132處理的P6蛋白降解速率

10、變慢，說明26S蛋白酶體抑制劑MG132能抑制P6蛋白的降解，表明P6蛋白通過26S蛋白酶體途徑降解。
　　體內(nèi)驗證蛋白酶體抑制劑能抑制ZFP介導(dǎo)P6蛋白降解將含有pCAM2300-P6-GFP與pCM1307-ZFP-3*flag質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共浸潤本氏煙，100uM的MG132和100uM的CHX（放線菌酮）一起注射已注射過P6和ZFP共浸潤的葉片中，Western blot檢測P6蛋白的表達量，結(jié)果表明MG132能夠抑制由ZF

11、P蛋白介導(dǎo)P6蛋白的降解。
　　6.森林草莓ZFP蛋白影響P6蛋白介導(dǎo)PVX在本氏煙上的癥狀表型
　　將含有pGR106-ZFP、pGR106-P6和pGR106表達載體的農(nóng)桿菌注射本氏煙，10天后比較分析癥狀差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當pGR106-P6與pGR106空載體共浸潤時，產(chǎn)生的癥狀與P6蛋白所表現(xiàn)的癥狀無明顯差異，而當pGR106-ZFP與pGR106-P6共浸潤時，植株表現(xiàn)出的癥狀比單獨P6蛋白產(chǎn)生的癥狀微弱，說明ZF