miR-107介導Endophilin-1參與血腦屏障通透性的調控及其相關機制.pdf

1、目的
　　血腦屏障(BBB)的存在極大的限制了大分子藥物通過血腦屏障進入腦組織，如何轉運大分子藥物通過血腦屏障是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療亟待解決的一個關鍵問題。血腦屏障在正常生理條件下只允許氣體分子及相對分子質量小于0.6kD的脂溶性小分子通過。藥物通過血腦屏障進入腦組織主要有兩條途徑:跨細胞途徑（增加吞飲小泡的數(shù)量）和細胞旁途徑（開放緊密連接）。
　　Endophilin-1是1996年從白血病兒童的血液中克隆的。它主要存在于

2、腦組織中，參與突觸囊泡的內陷(invagination)、剪切(fission/scission)，從而調節(jié)囊泡內吞回收。近期研究顯示Endophilin-1在腎臟組織中表達，并且調控足細胞的發(fā)育、形成，調控腎濾過膜屏障的通透性，提示Endophilin-1可能參與屏障通透性的調節(jié)。另外，有研究提示Endophilin-1參與細胞表面EGFR的內吞和降解過程，影響EGFR-ERK1/2通路的活性，而ERK1/2參與調節(jié)緊密連接相關蛋白的

3、表達，進而影響通透性。目前對于Endophilin-1能否通過影響EGFR-ERK1/2通路的活性調節(jié)血腦屏障通透性的研究尚未見報道。
　　MicroRNA作為長度約為20-24個核苷酸的小RNA，不編碼蛋白質。miRNAs與下游靶基因的信使RNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)結合，抑制信使RNA的表達，導致靶基因的表達下調。很多MicroRNA在腦組織的生理和病理狀態(tài)存在表達差異。近年來，在神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變中MicroRNA表

4、達及功能研究越來越得到關注。2008年發(fā)現(xiàn)miR-107在阿爾茨海默病(AD)腦組織中表達下調。同時有研究證實，Endophilin-1在AD患者早期的腦組織中即出現(xiàn)表達上調。軟件預測miR-107和Endophilin-1的3'-UTR存在結合位點。所以我們推測，在AD中，miR-107下調可能引起Endophilin-1表達上調。另外，AD患者腦組織標本和動物模型中均發(fā)現(xiàn)BBB通透性增大。鑒于Endophilin-1可能參與BBB通

5、透性調節(jié)，因此我們推測，miR-107可能通過介導Endophilin-1參與AD的BBB通透性調節(jié)。
　　我們的研究目的是檢測Endophilin-1是否在人微血管內皮細胞中表達，進而研究Endophilin-1是否調控血腦屏障通透性以及可能的分子機制，為選擇性開放血腦屏障提供新的靶點。另外，明確miR-107在Aβ1-42孵育的體外血腦屏障模型中表達，并且研究miR-107是否介導Endophilin-1參與調節(jié)Aβ1-42孵

6、育的體外血腦屏障通透性及其機制。
　　方法
　　第一部分Endophilin-1調控血腦屏障通透性機制研究
　　1、分別構建Endophilin-1、ZO-1、occludin的過表達和表達沉默質粒。
　　2、構建體外血腦屏障模型。
　　3、Westernblot檢測Endophilin-1的表達，免疫熒光檢測Endophilin-1的細胞定位。
　　4、應用Millicell-ERS電阻測量系統(tǒng)檢測

7、Endophilin-1過表達或表達沉默后血腦屏障的跨內皮細胞電阻值(transendothelialelectricresistance，TEER)的變化，應用葡聚糖通透性實驗檢測血腦屏障通透性變化。
　　5、Westernblot測定Endophilin-1過表達或表達沉默后ZO-1、occludin、EGFR、ERK1/2、p-ERK1/2表達量的改變。
　　6、免疫熒光測定Endophilin-1過表達或表達沉默后E

8、GFR、ZO-1、occludin的定位及表達變化。
　　7、應用免疫共沉淀方法測定Endophilin-1和EGFR互作。
　　第二部分miR-107通過下調Endophilin-1的表達調節(jié)阿爾茨海默病血腦屏障通透性機制研究
　　1、CCK-8細胞活力和增殖實驗檢測不同濃度的Aβ1-42作用不同時間對人腦微血管內皮細胞細胞活力的影響。
　　2、辣根過氧化物酶（HRP）滲透性實驗檢測Aβ1-42孵育體外BBB通

9、透性。
　　3、Real-timePCR檢測miR-107在Aβ1-42孵育的體外血腦屏障模型中表達。
　　4、HRP滲透性實驗檢測沉默miR-107對Aβ1-42孵育的體外血腦屏障模型通透性的影響。
　　5、Westernblot檢測沉默miR-107對緊密連接相關蛋白ZO-1和Occludin表達的影響。
　　6、熒光素酶報告基因檢測miR-107和Endophilin-1的3'非翻譯區(qū)直接結合。
　　

10、7、Real-timePCR和Westernblot驗證miR-107調控Endophilin-1表達。
　　8、Endophilin-1參與miR-107調控Aβ1-42孵育的體外血腦屏障模型通透性改變。
　　結果
　　第一部分Endophilin-1調控血腦屏障通透性機制研究
　　1、Endophilin-1在人微血管內皮細胞中內源性表達。
　　2、Endophilin-1參與調控血腦屏障通透性。End

11、ophilin-1過表達導致人腦微血管內皮細胞通透性增高，Endophilin-1表達沉默導致人腦微血管內皮細胞通透性降低。
　　3、Endophilin-1調控緊密連接相關蛋白的表達。Endophilin-1過表達引起ZO-1、occludin表達量下調，Endophilin-1表達沉默引起ZO-1、occludin表達量上調。
　　4、ZO-1、occludin表達量的變化影響血腦屏障通透性。Endophilin-1過表

12、達組細胞轉染ZO-1或occludin過表達質粒，可部分阻斷Endophilin-1過表達所導致的通透性增加。Endophilin-1表達沉默組細胞轉染ZO-1或occludin表達沉默質粒，可部分阻斷Endophilin-1表達沉默所導致的通透性減小，對ZO-1的阻斷程度大于occludin。
　　5、Endophilin-1可以影響EGFR-ERK1/2通路活性。免疫熒光示Endophilin-1與EGFR存在共定位;免疫共沉

13、淀示Endophilin-1與EGFR互作;Endophilin-1過表達引起EGFR、p-ERK1/2表達量下調，Endophilin-1表達沉默引起EGFR、p-ERK1/2表達量上調。
　　6、EGFR-ERK1/2通路抑制劑可以阻斷Endophilin-1沉默導致的通透性下調。應用AG1478（EGFR抑制劑）、PD98059(ERK1/2抑制劑)之后可以明顯阻斷Endophilin-1沉默導致的BBB通透性下調。

14、　　7、EGFR-ERK1/2通路抑制劑可以阻斷Endophilin-1沉默導致的ZO-1或occludin表達上調。應用AG1478（EGFR抑制劑）、PD98059(ERK1/2抑制劑)之后可以明顯阻斷Endophilin-1沉默導致的ZO-1或occludin表達上調。
　　第二部分miR-107通過下調Endophilin-1的表達調節(jié)阿爾茨海默病血腦屏障通透性機制研究
　　1、Aβ1-42導致體外血腦屏障模型通透性

15、增大。
　　2、miR-107在Aβ1-42孵育的體外血腦屏障模型中表達下調。
　　3、沉默miR-107導致Aβ1-4孵育的體外血腦屏障模型通透性增大。
　　4、沉默miR-107導致緊密連接相關蛋白ZO-1和Occludin表達下調。
　　5、miR-107和Endophilin-1的3'非翻譯區(qū)直接結合。
　　6、沉默miR-107上調Endophilin-1的mRNA和蛋白表達。
　　7、En

16、dophilin-1參與miR-107調控Aβ1-42孵育的體外血腦屏障模型通透性改變。
　　結論
　　第一部分Endophilin-1調控血腦屏障通透性機制研究
　　1、Endophilin-11在人腦微血管內皮細胞中表達。
　　2、Endophilin-1的表達變化影響血腦屏障通透性。
　　3、Endophilin-1的表達變化影響緊密連接相關蛋白ZO-1、occludin的表達。
　　4、End

17、ophilin-l在人腦微血管內皮細胞中介導EGFR的內吞和降解，調節(jié)EGF-ERK1/2通路的活化狀態(tài)
　　5、Endophilin-Ⅰ通過EGF-ERK1/2通路調控BBB通透性和緊密連接相關蛋白0-1、occludin的表達。
　　第二部分miR-107通過下調Endophilin-1的表達調節(jié)阿爾茨海默病血腦屏障通透性機制研究
　　1、miR107在Aβ1-42孵育的體外血腦屏障模型中表達顯著下調。