miR-107介導(dǎo)Endophilin-1參與血腦屏障通透性的調(diào)控及其相關(guān)機(jī)制.pdf

1、目的
　　血腦屏障(BBB)的存在極大的限制了大分子藥物通過血腦屏障進(jìn)入腦組織，如何轉(zhuǎn)運(yùn)大分子藥物通過血腦屏障是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵問題。血腦屏障在正常生理?xiàng)l件下只允許氣體分子及相對(duì)分子質(zhì)量小于0.6kD的脂溶性小分子通過。藥物通過血腦屏障進(jìn)入腦組織主要有兩條途徑:跨細(xì)胞途徑（增加吞飲小泡的數(shù)量）和細(xì)胞旁途徑（開放緊密連接）。
　　Endophilin-1是1996年從白血病兒童的血液中克隆的。它主要存在于

2、腦組織中，參與突觸囊泡的內(nèi)陷(invagination)、剪切(fission/scission)，從而調(diào)節(jié)囊泡內(nèi)吞回收。近期研究顯示Endophilin-1在腎臟組織中表達(dá)，并且調(diào)控足細(xì)胞的發(fā)育、形成，調(diào)控腎濾過膜屏障的通透性，提示Endophilin-1可能參與屏障通透性的調(diào)節(jié)。另外，有研究提示Endophilin-1參與細(xì)胞表面EGFR的內(nèi)吞和降解過程，影響EGFR-ERK1/2通路的活性，而ERK1/2參與調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白的

3、表達(dá)，進(jìn)而影響通透性。目前對(duì)于Endophilin-1能否通過影響EGFR-ERK1/2通路的活性調(diào)節(jié)血腦屏障通透性的研究尚未見報(bào)道。
　　MicroRNA作為長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸的小RNA，不編碼蛋白質(zhì)。miRNAs與下游靶基因的信使RNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)結(jié)合，抑制信使RNA的表達(dá)，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)下調(diào)。很多MicroRNA在腦組織的生理和病理狀態(tài)存在表達(dá)差異。近年來，在神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變中MicroRNA表

4、達(dá)及功能研究越來越得到關(guān)注。2008年發(fā)現(xiàn)miR-107在阿爾茨海默病(AD)腦組織中表達(dá)下調(diào)。同時(shí)有研究證實(shí)，Endophilin-1在AD患者早期的腦組織中即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。軟件預(yù)測(cè)miR-107和Endophilin-1的3'-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)。所以我們推測(cè)，在AD中，miR-107下調(diào)可能引起Endophilin-1表達(dá)上調(diào)。另外，AD患者腦組織標(biāo)本和動(dòng)物模型中均發(fā)現(xiàn)BBB通透性增大。鑒于Endophilin-1可能參與BBB通

5、透性調(diào)節(jié)，因此我們推測(cè)，miR-107可能通過介導(dǎo)Endophilin-1參與AD的BBB通透性調(diào)節(jié)。
　　我們的研究目的是檢測(cè)Endophilin-1是否在人微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，進(jìn)而研究Endophilin-1是否調(diào)控血腦屏障通透性以及可能的分子機(jī)制，為選擇性開放血腦屏障提供新的靶點(diǎn)。另外，明確miR-107在Aβ1-42孵育的體外血腦屏障模型中表達(dá)，并且研究miR-107是否介導(dǎo)Endophilin-1參與調(diào)節(jié)Aβ1-42孵

6、育的體外血腦屏障通透性及其機(jī)制。
　　方法
　　第一部分Endophilin-1調(diào)控血腦屏障通透性機(jī)制研究
　　1、分別構(gòu)建Endophilin-1、ZO-1、occludin的過表達(dá)和表達(dá)沉默質(zhì)粒。
　　2、構(gòu)建體外血腦屏障模型。
　　3、Westernblot檢測(cè)Endophilin-1的表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)Endophilin-1的細(xì)胞定位。
　　4、應(yīng)用Millicell-ERS電阻測(cè)量系統(tǒng)檢測(cè)

7、Endophilin-1過表達(dá)或表達(dá)沉默后血腦屏障的跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值(transendothelialelectricresistance，TEER)的變化，應(yīng)用葡聚糖通透性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血腦屏障通透性變化。
　　5、Westernblot測(cè)定Endophilin-1過表達(dá)或表達(dá)沉默后ZO-1、occludin、EGFR、ERK1/2、p-ERK1/2表達(dá)量的改變。
　　6、免疫熒光測(cè)定Endophilin-1過表達(dá)或表達(dá)沉默后E

8、GFR、ZO-1、occludin的定位及表達(dá)變化。
　　7、應(yīng)用免疫共沉淀方法測(cè)定Endophilin-1和EGFR互作。
　　第二部分miR-107通過下調(diào)Endophilin-1的表達(dá)調(diào)節(jié)阿爾茨海默病血腦屏障通透性機(jī)制研究
　　1、CCK-8細(xì)胞活力和增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的Aβ1-42作用不同時(shí)間對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞活力的影響。
　　2、辣根過氧化物酶（HRP）滲透性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Aβ1-42孵育體外BBB通

9、透性。
　　3、Real-timePCR檢測(cè)miR-107在Aβ1-42孵育的體外血腦屏障模型中表達(dá)。
　　4、HRP滲透性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默miR-107對(duì)Aβ1-42孵育的體外血腦屏障模型通透性的影響。
　　5、Westernblot檢測(cè)沉默miR-107對(duì)緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)的影響。
　　6、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-107和Endophilin-1的3'非翻譯區(qū)直接結(jié)合。
　　

10、7、Real-timePCR和Westernblot驗(yàn)證miR-107調(diào)控Endophilin-1表達(dá)。
　　8、Endophilin-1參與miR-107調(diào)控Aβ1-42孵育的體外血腦屏障模型通透性改變。
　　結(jié)果
　　第一部分Endophilin-1調(diào)控血腦屏障通透性機(jī)制研究
　　1、Endophilin-1在人微血管內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá)。
　　2、Endophilin-1參與調(diào)控血腦屏障通透性。End

11、ophilin-1過表達(dá)導(dǎo)致人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高，Endophilin-1表達(dá)沉默導(dǎo)致人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性降低。
　　3、Endophilin-1調(diào)控緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)。Endophilin-1過表達(dá)引起ZO-1、occludin表達(dá)量下調(diào)，Endophilin-1表達(dá)沉默引起ZO-1、occludin表達(dá)量上調(diào)。
　　4、ZO-1、occludin表達(dá)量的變化影響血腦屏障通透性。Endophilin-1過表

12、達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZO-1或occludin過表達(dá)質(zhì)粒，可部分阻斷Endophilin-1過表達(dá)所導(dǎo)致的通透性增加。Endophilin-1表達(dá)沉默組細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZO-1或occludin表達(dá)沉默質(zhì)粒，可部分阻斷Endophilin-1表達(dá)沉默所導(dǎo)致的通透性減小，對(duì)ZO-1的阻斷程度大于occludin。
　　5、Endophilin-1可以影響EGFR-ERK1/2通路活性。免疫熒光示Endophilin-1與EGFR存在共定位;免疫共沉

13、淀示Endophilin-1與EGFR互作;Endophilin-1過表達(dá)引起EGFR、p-ERK1/2表達(dá)量下調(diào)，Endophilin-1表達(dá)沉默引起EGFR、p-ERK1/2表達(dá)量上調(diào)。
　　6、EGFR-ERK1/2通路抑制劑可以阻斷Endophilin-1沉默導(dǎo)致的通透性下調(diào)。應(yīng)用AG1478（EGFR抑制劑）、PD98059(ERK1/2抑制劑)之后可以明顯阻斷Endophilin-1沉默導(dǎo)致的BBB通透性下調(diào)。

14、　　7、EGFR-ERK1/2通路抑制劑可以阻斷Endophilin-1沉默導(dǎo)致的ZO-1或occludin表達(dá)上調(diào)。應(yīng)用AG1478（EGFR抑制劑）、PD98059(ERK1/2抑制劑)之后可以明顯阻斷Endophilin-1沉默導(dǎo)致的ZO-1或occludin表達(dá)上調(diào)。
　　第二部分miR-107通過下調(diào)Endophilin-1的表達(dá)調(diào)節(jié)阿爾茨海默病血腦屏障通透性機(jī)制研究
　　1、Aβ1-42導(dǎo)致體外血腦屏障模型通透性

15、增大。
　　2、miR-107在Aβ1-42孵育的體外血腦屏障模型中表達(dá)下調(diào)。
　　3、沉默miR-107導(dǎo)致Aβ1-4孵育的體外血腦屏障模型通透性增大。
　　4、沉默miR-107導(dǎo)致緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)下調(diào)。
　　5、miR-107和Endophilin-1的3'非翻譯區(qū)直接結(jié)合。
　　6、沉默miR-107上調(diào)Endophilin-1的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　7、En

16、dophilin-1參與miR-107調(diào)控Aβ1-42孵育的體外血腦屏障模型通透性改變。
　　結(jié)論
　　第一部分Endophilin-1調(diào)控血腦屏障通透性機(jī)制研究
　　1、Endophilin-11在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。
　　2、Endophilin-1的表達(dá)變化影響血腦屏障通透性。
　　3、Endophilin-1的表達(dá)變化影響緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin的表達(dá)。
　　4、End

17、ophilin-l在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中介導(dǎo)EGFR的內(nèi)吞和降解，調(diào)節(jié)EGF-ERK1/2通路的活化狀態(tài)
　　5、Endophilin-Ⅰ通過EGF-ERK1/2通路調(diào)控BBB通透性和緊密連接相關(guān)蛋白0-1、occludin的表達(dá)。
　　第二部分miR-107通過下調(diào)Endophilin-1的表達(dá)調(diào)節(jié)阿爾茨海默病血腦屏障通透性機(jī)制研究
　　1、miR107在Aβ1-42孵育的體外血腦屏障模型中表達(dá)顯著下調(diào)。