大鼠體外循環(huán)后腸粘膜屏障功能障礙及谷氨酰胺保護作用機制研究.pdf

1、體外循環(huán)(CPB)對機體是一種全身性的強刺激，能引起機體產生應激反應。應激引起的過度的炎癥反應造成組織損害、多器官功能障礙(MODS)，是心臟外科術后死亡的主要原因。CPB過程中器官保護是心血管外科基礎臨床研究熱點之一。一直以來，人們對CPB所致的心、腦、肺、腎等重要器官的研究較多，也比較深入，而其對腸屏障功能影響及其機制缺乏深入系統(tǒng)研究。腸道是應激反應的中心器官和重要靶器官之一。因此研究CPB過程中腸屏障損傷的發(fā)生機制及探討相應的保護

2、措施具有極其重要的臨床意義。 本研究通過建立大鼠CPB動物模型，對CPB的大鼠進行隨機分組，常規(guī)CPB組和GLN干預CPB組(簡稱G組，術前3天開始尾靜脈注射丙氨酰－谷氨酰胺溶液2ml/kg，1/日，預充液中加入2ml/kg)，同時設立假手術組(SH組)和正常對照組(N組)。通過放射免疫法觀察CPB后血漿中TNF-α、IL-6等炎性細胞因子水平的變化；分光光度法測定反映腸屏障功能變化的指標如血漿D-乳酸濃度和DAO活性及腸粘膜組

3、織DAO活性；光鏡電鏡和TUNEL方法觀察CPB后IEC凋亡情況；放射免疫法、免疫組化、免疫熒光、天狼猩紅染色等方法并利用圖像分析軟件分析腸粘膜組織ECM成分改變；RT-PCR和Westernblot方法從mRNA和蛋白質水平測定MMPs/TIMPs和HSP72的表達；明膠酶譜法反映MMPs的明膠分解活性；并且對所得結果采用SPSS11.0軟件進行相應的統(tǒng)計學分析。 研究主要結果如下：1.通過微型化CPB環(huán)路設備，經右頸靜脈腔房

4、引流、左頸動脈灌注方法成功建立建立大鼠CPB模型，轉流過程中血流動力學、血氣分析等指標均在正常范圍，術后可以長期生存。 2.通過建立的大鼠CPB模型，采用病理形態(tài)學分析，超微結構觀察，放射免疫和分光光度計的技術方法，研究腸粘膜屏障功能變化對CPB后早期全身炎癥反應的影響。結果發(fā)現： 1)CPB組小腸部分絨毛水腫、片狀壞死、脫落，固有層血管充血、中性粒細胞浸潤及淋巴細胞浸潤、柱狀上皮壞死，部分絨毛斷裂、脫落。超微結構主要表

5、現上皮細胞微絨毛稀疏、排列不整、呈倒伏狀、部分缺如；上皮細胞連接增寬、部分緊密連接增寬或開放。N組和SH組明顯好于CPB組。 2)CPB后大鼠處于全身炎癥反應狀態(tài)，與N組和SH組相比較，CPB組血漿TNF-α和IL-6濃度明顯升高(P＜0.01)；SH組血漿TNF-αα和IL-6濃度比N組也有明顯升高(P＜0.05)。 3)大鼠經歷CPB后出現腸屏障功能損害。與SH和N組相比，CPB組血漿中DAO活性、D-乳酸濃度顯著升

6、高(P＜0.05)，腸粘膜組織DAO活性顯著降低(P＜0.05)。并且出現內毒素血癥，CPB組腸靜脈血漿LPS濃度明顯升高(P＜0.05)，而對照組之間差異無顯著性(P=0.316)。 4)線性回歸及相關分析表明：血漿DAO活性、D-乳酸和LPS濃度與血漿TNF-α和IL-6濃度之間呈現正相關，并且與血漿DAO活性和D-乳酸濃度相關性更顯著。說明腸屏障功能損害在CPB后全身炎癥反應的發(fā)生中起重要作用。 3.采用免疫組化、

7、免疫熒光、天狼猩紅染色、TUNEL、放免分析、RT-PCR、Westernblot和明膠酶譜法等技術方法，從IEC和ECM兩個方面在細胞和分子水平研究CPB 后腸屏障損害的機制。結果發(fā)現：1)CPB大鼠腸上皮細胞凋亡明顯增加，光鏡、電鏡和TUNEL獲得了相同結果觀察，CPB組凋亡指數較對照組明顯升高；相關分析表明AI與血漿DAO活性、D-乳酸和LPS濃度呈現顯著正相關，與腸組織DAO活性呈顯著的負相關，說明CPB后腸上皮凋亡上調

8、是腸功能損害的細胞學基礎。 2)小腸粘膜ECM構成及含量明顯變化。免疫組化結果顯示CPB組層粘連蛋白(LN)和Ⅳ型膠原蛋白表達下降，出現上皮基底膜變薄，部分出現斷裂消失；免疫熒光顯示CPB組LN熒光強度降低；超微結構觀察CPB組出現上皮細胞基底膜不完整甚至缺如；放射免疫定量分析顯示LN和Ⅳ型膠原含量在CPB后明顯下降，顯著低于SH組和N組(P＜0.01，P＜0.01)；天狼猩紅染色偏振光顯微鏡下膠原定性結果顯示：N組和SH組小腸

9、粘膜染色為紅黃色和綠色，即間質性ECM中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量豐富，排列整齊；CPB組可見條索狀的染色明顯減少，排列紊亂交錯，紅黃色的Ⅰ型膠原減少明顯。圖像分析結果顯示CPB組小腸組織CVF明顯減少。 3)小腸粘膜ECM變化與細胞凋亡和腸屏障功能存在相關性。線性回歸及相關分析顯示CPB后小腸粘膜LN、Ⅳ型膠原含量變化與細胞凋亡數呈顯著的負相關(r=-0.568，r=-0.645，P＜0.05)。CPB后小腸粘膜LN、Ⅳ型膠原含量、CV

10、F與血漿DAO活性和D-乳酸濃度呈顯著的負相關(P＜0.05)。其中Ⅳ型膠原含量相關性更顯著(P＜0.01)。由此可見小腸粘膜ECM結構和構成變化可以引起IEC的失巢性凋亡，二者共同造成腸屏障功能的損害。 4)腸源性MMP-9的表達增加和激活是造成炎癥反應，細胞凋亡和ECM變化的主要機制。RT-PCR和Westernblot檢測發(fā)現與N組和SH組相比較，CPB組MMP-9在轉錄和翻譯水平上均上調(P＜0.01)，而TIMP-1的

11、表達均無明顯變化。明膠酶譜法分析表明CPB組小腸粘膜組織中MMP-2、MMP-9活性均顯著增強，并與MMP活性/TIMP-1變化相一致。結果提示CPB后腸粘膜ECM含量下降是通過膠原降解增加而不是合成減少來實現的，MMPs的激活在CPB后小腸粘膜損害和功能障礙發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 5)MMP-9參與CPB后全身炎癥反應。MMP-9活性和血漿TNF-α濃度直線相關分析結果提示二者存在顯著正相關(r=0.879,P＜0.05)。提

12、示MMP-9活化可能對CPB術后全身炎癥反應的發(fā)生發(fā)展中起到直接作用。 4.采用前述方法，通過觀察Ala-Gln預處理對CPB后腸損害的保護作用并探討相應機制，結果發(fā)現與CPB組相比，G組大鼠腸粘膜組織形態(tài)學、腸屏障功能較有明顯改善；炎癥因子TNF-α和IL-6水平明顯降低，炎癥反應減輕；腸上皮細胞凋亡指數下降；ECM成分破壞減少，MMPs/TIMPs系統(tǒng)平衡狀況有所改善。應激蛋白HSP72的表達在G組明顯高于CPB組和SH組。

13、 結論本課題在建立了大鼠CPB動物模型的基礎上，從IEC和腸粘膜ECM兩個方面，在細胞和分子水平闡述了CPB后腸粘膜屏障功能損害的發(fā)生機制以及其與全身炎癥反應的關系，并探討Gln預充對CPB后腸損害的保護作用及機制。結果表明CPB術后存在腸粘膜功能損害，并且腸功能障礙在CPB術后全身炎癥反應發(fā)生發(fā)展中起重要作用。其機制主要通過三個方面：①腸粘膜上皮細胞凋亡上調是腸損害的細胞學基礎之一；②腸粘膜ECM的改變造成細胞的失巢性凋亡增加

14、，并可直接造成腸屏障功能障礙；③腸源性MMPs/TIMPs平衡破壞，MMPs表達增加與活化，造成了ECM降解、細胞凋亡和炎癥反應，是CPB術后腸屏障功能損害發(fā)生的重要的分子機制之一。Gln預處理可以通過誘導應激蛋白表達、抗凋亡和減輕炎癥反應等途徑對CPB后腸屏障功能起到一定程度的保護作用。綜合本研究的結果我們有理由相信啟動內源性防衛(wèi)機制、下調細胞凋亡和調控MMPs活性有可能成為CPB過程中腸屏障功能保護、降低全身炎癥反應的新靶點，對于降